“Desarrollo de un método para detectar la presencia de cisteín proteasas en extractos vegetales por un medio de análisis de mapas peptídicos por MALDI-TOF”

OBREGÓN, W.D.; TREJO, S.A.; LIGGIERI, C.L.; MORCELLE, S.R.; HERNÁNDEZ. M.; PRIOLO, N.

Ciego de Ávila, Cuba

Congreso; VII Congreso Internacional Biotecnología y Agricultura BIOVEG 2007; 2007

Desarrollo de un método para detectar la presencia de cisteín proteasas en extractos vegetales por medio del análisis de mapas peptídicos por MALDI-TOF Obregón, W.D. 1; Trejo, S.A.2; Liggieri, C.L.1; Morcelle, S.R.1; Hernández, M.3; Priolo, N.S.1 1Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales (LIPROVE), Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs. Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina 2Instituto de Biotecnología y Biomedicina (IBB), Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona, España 3Laboratorio de Ingeniería Metabólica, Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila, Ciego de Ávila, Cuba. e-mail: davidobregon@biol.unlp.edu.ar Resumen Con el objeto de confirmar que las enzimas proteolíticas contenidas en el látex de las especies Araujia angustifolia Decaisne (Hook et Arn.)1 y Araujia hortorum Fourn2,3 (ya caracterizadas por métodos convencionales) son isoenzimas, se procedió a realizar una digestión tríptica de las mismas en geles de poliacrilamida para obtener los mapas peptídicos mediante la técnica de MALDI-TOF. En este trabajo, se propone emplear a futuro esta herramienta fundamental de la proteómica para detectar cisteín proteasas en extractos vegetales. Para ello se trabajó con extractos enzimáticos y con las fracciones puras correspondientes a cada una de las especies vegetales nombradas precedentemente (araujiaína aI, aII y aIII, y araujiaína hI, hII y hIII respectivamente). Para obtener la huella peptídica (peptide mass fingerprint, PMF) por MALDI-TOF MS (PMF MALDI-TOF MS) se hizo una digestión tríptica in situ de las proteínas separadas mediante SDS-PAGE y coloreadas por la técnica de Coomassie coloidal. Las bandas seleccionadas fueron recortadas con bisturí y almacenadas en tubos eppendorf para su procesamiento, luego se lavaron con agua MilliQ y ACN varias veces alternativamente hasta su decoloración y finalmente fueron secadas al vacío. Se agregaron ditiotreitol y iodoacetamida en NH4HCO3  para reducir y bloquear el sitio activo. La digestión se realizó con buffer NH4HCO3 conteniendo tripsina durante 12 horas a 37 °C, los productos finales se disolvieron en TFA 0,1% (v/v) y se analizaron por MALDI-TOF MS utilizando una matriz de HCCA. Los espectros obtenidos correspondientes a cada una de las enzimas tratadas demuestran que existen picos conservados en ambas especies y picos que las diferencian, lo que permitiría identificar posibles secuencias comunes así como secuencias propias de enzimas de especies distintas. De la misma manera cuando se compararon las tres enzimas araujiaína aI, aII y aIII de la especie A. angustifolia se demostró que poseen picos equivalentes entre sí y picos distintos, lo que demuestra que son diferentes pero con un alto grado de homología entre ellas. Este resultado, junto con los obtenidos mediante la metodología convencional sugieren con mayor certeza que se trataría de isoenzimas. Con dichos mapas trípticos y empleando la herramienta MASCOT4, que utiliza datos de espectrometría de masas para identificar proteínas en las bases de datos de secuencias primarias, se realizaron las búsquedas a fin de identificar las proteínas originales.