Inmovilización de fitoproteasas para su empleo como catalizadores en procesos biotecnológicos

MORCELLE DEL VALLE, S.R.; LIGGIERI, C.; VILLAGRA, E.; OJEDA, A.; BRUNO, M.; PRIOLO, N.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CYTAL); 2007

AATA

Antecedentes. Las proteasas representan las dos terceras partes de las enzimas que se comercializan en el mercado mundial. Fitoproteasas tales como papaína, bromelaína y ficaína son irreemplazables en un gran número de procesos de la industria alimentaria. El empleo de enzimas inmovilizadas permite un uso más eficaz del catalizador, al estabilizar la estructura proteica de la enzima y permite el desarrollo de procesos continuos o repetidos. Las ventajas son mayor resistencia a la desnaturalización, fácil separación de los productos de reacción, etc. La inmovilización por adsorción de proteasas sobre soportes sólidos (poliamida, celite) es un método sencillo y económico, y se ha aplicado para la síntesis enzimática de péptidos saborizantes y antimicrobianos. En este trabajo, se plantea la posibilidad de inmovilizar fitoproteasas novedosas presentes en los extractos (no comerciales) de plantas autóctonas y comparar la actividad de las mismas con endopeptidasas vegetales de origen comercial (papaína y bromelaína, Sigma) luego de ser depositadas en poliamida frente a distintos sustratos para evaluar la factibilidad de su empleo en procesos biotecnológicos como los mencionados. Materiales y métodos. Se emplearon los extractos crudos provenientes de látex de Araujia hortorum (araujiaína), Asclepias curassavica (asclepaína c) y Funastrum clausum (funastraína), así como de frutos de Bromelia hieronymi (hieronymaína). Los extractos crudos liofilizados (100 mg) se mezclaron con 1 g de poliamida, ditiotreitol (50 mg) y buffer bórico-borato 0,1 M (pH 8,5, 1 ml), y posteriormente secados por liofilización. Se determinó el porcentaje de actividad enzimática remanente de las preparaciones inmovilizadas frente a L-piroglutamil-L-fenilalanil-L-leucina-p-nitroanilida (PFLNA, 0,1). mM) en buffer fosfatos 0,1 M (pH 6,5) y 37 ºC por determinación a 410 nm de la pnitroanilina liberada (antes y después de inmovilizar cada enzima). Se probó la actividad de los inmovilizados a 37 ºC con agitación orbital (150 rpm) frente a Nα -carbobenzoxi-Larginina-p-nitroanilida (Z-Arg-pNA, 0,1 mM), Nα -benzoil-D,L-arginina-p-nitroanilida (BAPNA, 4 mM), Nα -carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina-p-nitroanilida (Z-Phe-ArgpNA, 0,1 mM) en buffer fosfatos 0,1 M (pH 7,4) y PFLNA. Se calcularon las unidades internacionales enzimáticas de los inmovilizados con cada sustrato mediante curvas de calibración de soluciones de p-nitroanilina. Resultados. Luego de la inmovilización, se recuperó entre el 20 y el 25% de la actividad. PFLNA y Z-Arg-pNA fueron buenos sustratos para determinar las actividades de todas las fitoproteasas inmovilizadas ensayadas. Araujiaína, funastraína y papaína mostraron muy buena actividad con BAPNA: asclepaína c, hieronymaína y bromelaína no reaccionaron con este sustrato. En su lugar se empleó Z-Phe-Arg-pNA, más específico, para determinar actividad de bromelaína y hieronymaína. Bromelaína tuvo 50% más de actividad con ZPhe-Arg-pNA que hieronymaína. Conclusiones. Se determinó que existe una pérdida de actividad enzimática importante luego de la inmovilización, debida probablemente a las condiciones de adsorción sobre el soporte. Z-Arg-pNA y PFLNA fueron buenos sustratos para la determinación de la actividad de las fitoproteasas inmovilizadas. Estos ensayos son promisorios para ajustar la actividad de las fitoproteasas adsorbidas en poliamida en procesos biotecnológicos.