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Introducción La lipasa B de Candida antarctica (CALB) es una lipasa muy utilizada industrialmente y posee diversas aplicaciones. Generalmente, se utiliza CALB inmovilizada en distintos soportes. En este sentido, uno de los biocatalizadores comerciales más usados basados en esta lipasa es Novozym 435 (Novo Nordisk) en el que la CALB está soportada sobre una resina de polimetilmetacrilato. Sin embargo, estudios recientes demostraron que la resina soporte del biocatalizador Novozym® 435 se disuelve en medios orgánicos conduciendo a la pérdida de enzima, desactivación del biocatalizador y contaminación del producto1,2. Por otra parte, se ha comprobado que es posible inmovilizar CALB sobre TiO2 sin afectar su conformación3. En el presente trabajo, se prepararon y optimizaron biocatalizadores basados en CALB inmovilizada sobre TiO2 y se usaron en la esterificación enantioselectiva de (R,S)-ibuprofeno con etanol4. Metodología Inmovilización de CALB sobre TiO2 Soluciones de CALB purificada y del extracto crudo comercial de la misma (EC) en agua destilada (concentración de proteínas comprendida entre 0,5 y 1,5 mg/mL en ambos casos) se mezclaron, en frascos de vidrio con 100 mg de dióxido de titanio (P-25 Evonik Industries, superficie específica 43.1 m2/g, nanopartículas de 20 nm en promedio). El dióxido de titanio fue previamente calcinado a 500 ºC por 12 hs. Dichas mezclas se incubaron a 30ºC durante 1 hora con agitador magnético. Transcurrido el tiempo de incubación, las mezclas se centrifugaron a 9600g durante 20 minutos. Los sólidos fueron resuspendidos en agua destilada y se volvieron a centrifugar en las mismas condiciones. Todos los sobrenadantes se reservaron para analizar. Los sólidos fueron secados mediante liofilización durante 48 hs. Los preparados con CALB pura se denominan CT mientras que los preparados con EC se denominan CT*. Cálculo de las proteínas adsorbidas y saturación del soporte Para calcular la cantidad de proteínas adsorbidas sobre el óxido se midió el contenido proteico de las muestras iniciales y los sobrenadantes finales mediante el método de Bradford, usando una curva de calibración realizada con CALB pura Sigma. Uso de los biocatalizadores en la esterificación de ibuprofeno Se realizaron distintos ensayos para poner a punto una técnica para esterificar ibuprofeno con etanol usando los biocatalizadores preparados. También fue probado el biocatalizador comercial Novozym 435 (Novo). Se ensayaron dos mezclas de reacción, sin cosolvente y con isooctano como cosolvente. Las mismas se dejaron incubando a 45ºC y agitación orbital durante 24 y 48 horas. Las mezclas de reacción y los blancos se titularon con KOH/EtOH usando fenolftaleína como indicador del punto final. Con los datos de volúmenes gastados en cada caso se calcularon los porcentajes de conversión. Para analizar la enantioselectividad de las reacciones, se analizaron por HPLC los contenidos remanentes de los isómeros del ibuprofeno en los ensayos donde hubo conversión. Resultados Proteínas adsorbidas y saturación del soporte En la figura se muestran los resultados de proteínas adsorbidas en función de las proteínas iniciales en algunos ensayos al usar soluciones de CALB purificada y de EC. En los ensayos con menores concentraciones iniciales se observa una adsorción casi completa de las proteínas mientras que a mayores valores crece el contenido de proteínas remanentes en los sobrenadantes. Esto está evidenciando un nivel de saturación del soporte. De acuerdo a estos datos 100 mg de soporte permite la adsorción de una cantidad entre 10 y 12 mg de proteínas en las condiciones detalladas. Se obtuvieron cantidades de proteínas adsorbidas muy similares cuando las soluciones enzimáticas iniciales fueron la CALB pura o el EC. Esterificación de ibuprofeno En la tabla se muestran los valores de conversión de ibuprofeno y exceso enantiomérico alcanzados a las 48 hs, con y sin isooctano en la mezcla de reacción, usando los biocatalizadores preparados y del biocatalizador comercial Novozym ® 435. Cada ensayo se hizo por triplicado. Biocat. Cosolvente C% ees% CT - 0 - CT* - 4.5 4.5 Novo - 14.5 14.3 CT Isooctano 3.6 - CT* Isooctano 67 57 Novo Isooctano 69 50 Se observó que el medio conteniendo isooctano fue el más apropiado para estos 3 biocatalizadores. En el caso de CT de no presentar actividad en el medio sin cosolvente pasó a tener una actividad mínima, en tanto que la actividad de CT* aumentó 15 veces y para el aumento de la actividad de Novozym® 435 fue de aproximadamente 5 veces. Por otra parte se advirtió una clara diferencia entre los biocatalizadores preparados con la lipasa purificada (CT) respecto de los preparados con el extracto crudo. Novo y CT* mostraron niveles de conversión a las 48 hs cercanos al 70% cuando se usaron las mismas cantidades de los dos biocatalizadores en el medio con isooctano. En este caso, CT* presentó un valor de ees% mayor que Novo. Conclusiones Se desarrolló y estudió una metodología para obtener, de manera muy sencilla y rápida, biocatalizadores económicos y útiles para ensayos de esterificación selectiva del ibuprofeno. Se obtuvo un máximo de 11 mg de proteínas adsorbidas cada 100 mg de TiO2. Se determinó que el uso de EC en lugar de la enzima pura da mucho mejores resultados aún cuando la cantidad de proteínas adsorbidas sea semejante. La presencia del cosolvente isooctano permitió porcentajes de conversión mucho más elevados en todos los ensayos realizados. Estos ensayos preliminares muestran que el biocatalizador preparado resulta ser una buena alternativa frente al biocatalizador comercial. Referencias 1. C. José, R.D. Bonetto, L.A. Gambaro, M.P. Guauque Torres, M.L. Foresti, M.L. Ferreira, L.E. Briand. Investigation of the causes of deactivation-degradation of the comercial biocatalyst Novozym® 435 in ethanol and ethanol?aqueous media, J. Mol. Catal. B: Enz. 71 (2011) 95-107. 2. C. José, L.E. Briand. Deactivation of Novozym® 435 during the esterification of ibuprofen with ethanol: evidences of the detrimental effect of the ethanol, React. Kinet. Mech. Catal. 99 (2010) 17-22. 3. M .L. Foresti, G. M. Valle, R. Bonetto, M.L. Ferreira and Laura E. Briand. FTIR, SEM and fractal dimension characterization of lipase B from Candida antarctica immobilized onto titania at selected conditions, Appl. Surf. Sc. 256 (2010) 1624-1635 4. M. L. Foresti, M. Galle, M. L. Ferreira, L. E. Briand. Enantioselective Esterification of Ibuprofen with Ethanol as Reactant and Solvent Catalyzed by Immobilized Lipase: Experimental and Molecular Modeling Aspects, J. Chem. Tech. Biotechnol. 84 (2009) 1461-1473.

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