Efecto de conidios de Aspergillus fumigatus sobre la actividad fagocitica y microbicida de macrofagos bovinos

FOCHESATO A., ; DOGI C, ; ALONSO V; CAVAGLIERI L. R

Congreso; VII Congreso latinoameriano micotoxicología; 2013

UNRC

EFECTO DE CONIDIOS DE Aspergillus fumigatus SOBRE LA ACTIVIDAD FAGOCITICA Y MICROBICIDA DE MACROFAGOS BOVINOS Fochesato A., Dogi C, Alonso V, Cavaglieri L. Departamento Microbiología e Inmunología. Universidad Nacional de Río Cuarto Consejo Nacional de Investigaciones Científica y Técnicas (CONICET) foche_anita@hotmail.com Aspergillus fumigatus es un microorganismo saprófito aislado de una amplia variedad de sustratos. Este hongo produce un importante número de metabolitos secundarios como gliotoxina, fumiclavinas y otros que han demostrado ser altamente tóxicos tanto para la salud humana como animal. Aspergillus fumigatus puede eludir las defensas locales del huésped mediante la síntesis de metabolitos tóxicos que inhiben la respuesta inmune. El objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad de cepas de diferentes orígenes de A. fumigatus de inhibir la actividad fagocítica y microbicida de macrófagos bovinos. Fueron identificadas 15 cepas de A. fumigatus según sus caractarísticas micro y macro morfológicas en diferentes medios de cultivo. A estas cepas se les determinó su capacidad toxicogénica a través de la medición de gliotoxina por HPLC. Los conidios de A. fumigatus se obtuvieron a partir de cultivos de 5 días a 37°C en agar extracto de malta (MEA) y luego se obtuvo una sustancia difusible (SD) a partir de los mismos. Para ello, los conidios (108/ml) se incubaron en solución de fosfatosa 37°C durante 3 h, luego fueron centrifugados y la SD filtrada a través de filtros de 0,22 μm. Una alícuota de las SD fue autoclavada (SDa). Se determinó el efecto citotóxico de las SD y SDa sobre linfocitos bovinos, evaluando la viabilidad de los mismos por el método de bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Para el ensayo de actividad fagocítica se utilizó la línea celular de macrófagos bovinos BoMac. Los mismos se cultivaron en portaobjetos con pocillos delimitados, con o sin SD o SDa durante 1h. Luego se lavaron con PBS y se incubaron con Saccharomyces cerevisiae (1x106 cel/ml) durante 3 h. Se lavó 3 veces con PBS para remover las levaduras no fagocitadas, las células se fijaron con metanol, se tiñó con Giemsa y se determinó por microscopio óptico el porcentaje de células con actividad fagocítica. Para el ensayo de actividad microbicida, las células Bomac fueron cultivadas en placas de 96 pocillos y tratadas con SD o SDa durante 1h. Se lavaron las células y se incubaron con una cepa de Salmonella spp. (1x109 cel/ml) durante 3 h. Luego de lavar para eliminar las bacterias no fagocitadas, las células fueron lisadas con Tween 20 al 0,5%, se tomaron 100l del sobrenadante y se hicieron diluciones seriadas para recuento en placa de Salmonella spp. intracelular. Las SD de todas las cepas ensayadas demostraron actividad citotóxica frente a linfocitos bovinos y disminuyeron la capacidad fagocítica de los macrófagos bovinos. Las SDa mostraron diferencias entre ellas, algunas mantuvieron la actividad citotóxica. La actividad microbicida disminuyó en presencia de la mayoría de las SD y SDa. Las cepas de A. fumigatus demostraron actividad citotóxica e inmunosupresora, a través de una sustancia obtenida de sus conidios. Esta actividad no estuvo relacionada con la producción de gliotoxina, por lo que sería interesante la caracterización de esta SD, ya que no está descripta en bibliografía. EFECTO DE CONIDIOS DE Aspergillus fumigatus SOBRE LA ACTIVIDAD FAGOCITICA Y MICROBICIDA DE MACROFAGOS BOVINOS Fochesato A., Dogi C, Alonso V, Cavaglieri L. Departamento Microbiología e Inmunología. Universidad Nacional de Río Cuarto Consejo Nacional de Investigaciones Científica y Técnicas (CONICET) foche_anita@hotmail.com Aspergillus fumigatus es un microorganismo saprófito aislado de una amplia variedad de sustratos. Este hongo produce un importante número de metabolitos secundarios como gliotoxina, fumiclavinas y otros que han demostrado ser altamente tóxicos tanto para la salud humana como animal. Aspergillus fumigatus puede eludir las defensas locales del huésped mediante la síntesis de metabolitos tóxicos que inhiben la respuesta inmune. El objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad de cepas de diferentes orígenes de A. fumigatus de inhibir la actividad fagocítica y microbicida de macrófagos bovinos. Fueron identificadas 15 cepas de A. fumigatus según sus caractarísticas micro y macro morfológicas en diferentes medios de cultivo. A estas cepas se les determinó su capacidad toxicogénica a través de la medición de gliotoxina por HPLC. Los conidios de A. fumigatus se obtuvieron a partir de cultivos de 5 días a 37°C en agar extracto de malta (MEA) y luego se obtuvo una sustancia difusible (SD) a partir de los mismos. Para ello, los conidios (108/ml) se incubaron en solución de fosfatosa 37°C durante 3 h, luego fueron centrifugados y la SD filtrada a través de filtros de 0,22 μm. Una alícuota de las SD fue autoclavada (SDa). Se determinó el efecto citotóxico de las SD y SDa sobre linfocitos bovinos, evaluando la viabilidad de los mismos por el método de bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Para el ensayo de actividad fagocítica se utilizó la línea celular de macrófagos bovinos BoMac. Los mismos se cultivaron en portaobjetos con pocillos delimitados, con o sin SD o SDa durante 1h. Luego se lavaron con PBS y se incubaron con Saccharomyces cerevisiae (1x106 cel/ml) durante 3 h. Se lavó 3 veces con PBS para remover las levaduras no fagocitadas, las células se fijaron con metanol, se tiñó con Giemsa y se determinó por microscopio óptico el porcentaje de células con actividad fagocítica. Para el ensayo de actividad microbicida, las células Bomac fueron cultivadas en placas de 96 pocillos y tratadas con SD o SDa durante 1h. Se lavaron las células y se incubaron con una cepa de Salmonella spp. (1x109 cel/ml) durante 3 h. Luego de lavar para eliminar las bacterias no fagocitadas, las células fueron lisadas con Tween 20 al 0,5%, se tomaron 100l del sobrenadante y se hicieron diluciones seriadas para recuento en placa de Salmonella spp. intracelular. Las SD de todas las cepas ensayadas demostraron actividad citotóxica frente a linfocitos bovinos y disminuyeron la capacidad fagocítica de los macrófagos bovinos. Las SDa mostraron diferencias entre ellas, algunas mantuvieron la actividad citotóxica. La actividad microbicida disminuyó en presencia de la mayoría de las SD y SDa. Las cepas de A. fumigatus demostraron actividad citotóxica e inmunosupresora, a través de una sustancia obtenida de sus conidios. Esta actividad no estuvo relacionada con la producción de gliotoxina, por lo que sería interesante la caracterización de esta SD, ya que no está descripta en bibliografía.