SELECCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y LEVADURAS POR SU POTENCIAL UTILIZACIÓN COMO PROBIÓTICO Y DECONTAMINANTE DE AFLATOXINA B1

ROMINA P. PIZZOLITTO, MARÍA R. ARMANDO, LILIA CAVAGLIERI, LUCILA BARBERIS, ANA DALCERO, MARIO SALVANO

Rio de Janeiro (Brasil)

Congreso; XIII Encuentro Internacional de Micotoxinas; 2008

07- SELECCIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS Y LEVADURAS POR SU POTENCIAL UTILIZACIÓN COMO PROBIÓTICO Y DECONTAMINANTE DE AFLATOXINA B1 ROMINA P. PIZZOLITTO1,3 MARÍA R. ARMANDO1, LILIA CAVAGLIERI2,3, LUCILA BARBERIS3, ANA DALCERO2,3, MARIO SALVANO3. 1Fellowship of Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCYT). 2Member of Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CIC-CONICET) 3Universidad Nacional de Río Cuarto. Ruta 36 km 601 (5800) Río Cuarto – Córdoba – ARGENTINA. rpizzolitto@exa.unrc.edu.ar Abstract. Aflatoxin B1 is ingested by animals through consumption of contaminated food and fodder. Developing control strategies is essential to ensure food safety for consumers. The detoxification of AFs by lactic acid bacteria (BAL) and yeast plays a role in the bioavailability of AFB1 and thus protect the consumer from the adverse effects of AFB1. The objectives of this study were 1) to characterize BAL and yeast strains isolated from different sources. 2 - to assess the detoxificant ability of AFB1  “in vitro” by BAL and yeast strains Palabras clave: bacterias ácido lácticas, levaduras, detoxificación de aflatoxina B1 Introducción. Las micotoxinas son metabolitos secundarios fúngicos capaces de desencadenar diversas alteraciones y cuadros patológicos en el hombre y animales. El género Aspergillus involucra especies productoras de aflatoxinas (AFs), la micotoxina de mayor implicancia en la salud debido a sus efectos carcinogénicos, teratogénicos y mutagénicos. Una alternativa es el empleo de microorganismos como agentes secuestrantes de toxina. La detoxificación de AFs por bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras juega un rol en la biodisponibilidad de AFB1 y así protegería al consumidor de los efectos adversos de esta micotoxina. Objetivos. Caracterizar cepas BAL y levaduras aisladas de diferentes orígenes. 2 - Evaluar la capacidad detoxificante de AFB1  “in vitro”  de cepas BAL y levaduras. Materiales y Métodos: Cepas BAL. Se emplearon 6 cepas BAL aisladas de diferentes orígenes: Lactobacullis fermentum (humano), L. rhamnosus (humanos), L. acidophilus (yogurt), L. casei supsp rhamnosus (yogurt), L. paracasei subsp. paracasei (yogurt) y L. rhamnosus (intestino). Se cultivaron en medio Man Rogosa Sharpe (MRS) en condiciones de microaerofìlia a 37ºC durante 24 h. Cepas Levaduras. Se emplearon 3 cepas de levaduras: Saccharomyces cerevisiae de uso en panificación (liofilizada), S. cerevisiae CECT 1891 y Saccharomyces sp. aislada a partir de materia fecal de pollo. Las cepas se desarrollaron en medio extracto de levadura, peptona, dextrosa (YPD) a 37ºC en condiciones de aerobiosis durante 24 hr. Aislamiento de levaduras a partir de materia fecal de pollo. Se colocó la materia fecal en 25 ml de agua peptonada (0.1%), se homogeneizó la muestra y se sembró con ansa en YPD, por el método de estrías por agotamiento, se incubaron a 37ºC durante 48 hr. Luego se procedió a su observación microscópica y se repicaron en placas de YPD para su posterior identificación. Ensayo de sensibilidad a antibióticos. Olsson- Liljequist (1997). Ensayo de adsorción de AFB1. Se emplearon para los ensayos BAL, viables y no viables,  las cuales se cultivaron en las condiciones mencionadas. Trucksess et al. (1994). Resultados y Discusión. Todas las cepas BAL fueron sensibles a las concentraciones de antibióticos empleadas (30 ug/disco) para cloranfenicol, estreptomicina y neomicina, siendo S. cerevisiae CECT 1891 resistente a los antibióticos antes mencionados (Tabla 1).Los resultados obtenidos en BAL son importantes para su futuro empleo como prebiótico, son incapaces de transferir genes de resistencia a antibióticos a microorganismos patógenos y de esta manera disminuir al riesgo para la salud humana y animal. En los ensayos con diferentes antibióticos se observó que todas las cepas BAL fueron sensibles a las concentraciones empleadas (30 ug/disco) para cloranfenicol, estreptomicina y neomicina, siendo S. cerevisiae CECT 1891 resistente a los antibióticos antes mencionados. Los resultados obtenidos en BAL son importantes para su futuro empleo como probiótico ya que son incapaces de transferir genes de resistencia a antibióticos a microorganismos patógenos y de esta manera disminuir al riesgo para la salud humana y animal. Se estudió la efectividad de remoción de AFB1 en medio líquido de las 6 cepas BAL y las 3 cepas de Saccharomyces  y se observó que cada cepa bacteriana mostró una interacción propia con AFB1 al igual que las cepas de levaduras. Al analizar si la viabilidad celular afectaba al proceso de adsorción  de la toxina, no hubo diferencias entre la eliminación de toxina por bacterias y levaduras viables y no viables, al igual que cuando se empleó Saccharomyces liofilizada (Tabla 2). Todas las cepas ensayadas aumentaron la captación de la toxina en medio líquido cuando se aumentó la concentración de la misma. El mecanismo involucrado es considerado una adsorción física a componentes de la pared celular (peptidoglicanos, polisacáridos y glucomananos) siendo estos los responsables de la unión de AFB1 (Bueno et al. 2007). Tabla 1: Ensayo de actividad antimicrobiana (BAL y S. cerevisiae CECT 1891 vs. cepas patógenas). Actividad antimicrobiana E. coli Salmonella sp Pseudomonas sp Enterococcus sp S. aureus S. cerevisiae ++ + ++ + - L. fermentum (H) +++ ++ +++ ++ + L. acidophilus (Y) +++ ++ +++ +++ +++ +, zona inhibición ≤ 9 mm y ≥ 3 mm; ++, zona inhibición ≤ 15 y ≥ 10 mm; +++ > 15 mm -, zona inhibición ≤ 3 Tabla 2: Adsorción de AFB1 por BAL y S. cerevisiae ensayadas a tres concentraciones de toxina. BAL y S. cerevisiae ensayadas Adsorción de AFB1 (ng/ml) 50 (ng/ml)a 100 (ng/ml)a 500 (ng/ml)a S. cerevisiae CECT1891 viable 1,9 22 107,4 S. cerevisiae CECT1891 no viable 19,3 21,3 100,3 S. cerevisiae CECT1891 liofilizada 4,4 82,8 322,2 Saccharomyces pollo 12,2 29,9 101,9 Saccharomyces panificación 49,3 98.4 411,7 Lactobacullis fermentum (H) viable 3,66 6,57 37,2 L.  fermentum (H) no viable 5,26 9,29 35,6 L. acidophilus (Y) viable 6,5 20,8 65,1 L. acidophilus (Y) no viable 6,1 19,4 75,3 L. casei supsp rhamnosus (Y) viable 25,2 81,9 341,6 L. casei supsp rhamnosus (Y)  no viable 31,7 96,8 418,7 L. rhamnosus (Int) viable 22,5 27,9 115,9 L. rhamnosus (Int) no viable 10,1 37,6 161,3 L. rhamnosus (H) viable 1,4 9,3 40,3 L. rhamnosus (H) no viable 4,5 10,1 34,1 L. paracasei  subsp. paracasei  (Y) viable 3,3 6,2 28,5 L. paracasei subsp. paracasei  (Y) no viable 2,5 5,9 21,3  aConcentración de AFB1 empleada. Concentración microorganismos 107 (cel/ml) Tiempo de interacción 30 min. a 37ºC. Los ensayos se realizaron por duplicado Conclusión.