CONFERENCIA: Avances en procesos de criopreservacion de material biológico.

ZARITZKY NOEMI.

ROSARIO

Jornada; Jornadas organizadas por el CENTRO BINACIONAL DE INVESTIGACIONES EN CRIOBIOLOGÍA CLÍNICA Y APLICADA; 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO

En esta presentación se discutirán dos temáticas:A) Estudios de transferencia de energia en dispositivos utilizados para criopreservación de germoplasma animal: El proceso de criopreservación consiste en reducir la temperatura de la muestra hasta alcanzar el punto de estabilidad biológica. En particular la medición experimental de la curva temperatura versus tiempo es fundamental para el cálculo de velocidades de enfriamiento y para detectar si la muestra ha sido vitrificada o si ha sufrido un proceso de cambio de fase (congelación) en la cual se forman cristales de hielo. Cuando un objeto se sumerge en Nitrógeno Líquido (LN2) entra en un régimen de ebullición en film debido a las grandes diferencias de temperatura entre el objeto y el LN2 (T). Este fenómeno ocurre debido a que el flujo calórico desde el objeto hacia el LN2 provoca la evaporación del nitrógeno en la cercanía del dispositivo generándose una capa de vapor aislante que retarda la transferencia de energía. Este fenómeno se lo conoce como efecto “Leidenfrost”. El conocimiento de las curvas de temperatura vs. tiempo permite determinar los coeficientes de transferencia de calor que gobiernan el proceso de enfriamiento: ebullición en film, y ebullición nucleada. A través del modelado y simulación numérica de las ecuaciones de transferencia de energía se estimaron los coeficientes de transferencia de calor en la interfase durante el enfriamiento de pajuelas plásticas conteniendo hielo o fluido biológico (semen + extender) cuando se sumergían las muestras en LN2. Se realizó la validación del programa contrastando las experiencias de laboratorio con las predicciones numéricas, y se logró una excelente concordancia. La simulación computacional es una herramienta importante para la optimización del proceso de criopreservación.(Santos y col. 2014). B) Criopreservación de semillas de cítricos: Argentina es uno de los países con mayor producción de cítricos a nivel mundial y se ubica en 2018 entre los 10 mayores productores y exportadores de limón. Citrus limon L. Burm cv. Eureka es una de las variedades más cultivadas en el país siendo su germoplasma un recurso estratégico para Argentina. Las semillas constituyen una forma reproductiva del vegetal para conservar el germoplasma. El almacenamiento de semillas en bancos de germoplasma las protege contra eventos catastróficos. En general, se reconocen tres categorías de comportamiento de semillas: ortodoxa, intermedia y recalcitrante. Las semillas intermedias no pueden almacenarse en nitrógeno líquido (LN) sin un proceso de deshidratación parcial previo. Se investigó el grado de deshidratación óptimo para la crioconservación de semillas de Citrus limón L. Burm cv. Eureka en nitrógeno líquido. Las semillas se sometieron a 8 condiciones de desecación en equilibrio (rango entre 11-85 % de humedad relativa, %HR) a 20 ºC. Se evaluó la viabilidad mediante el ensayo de germinación en arena (%G: % germinación) y la prueba de tetrazolio. Las semillas presentaron una tolerancia a la desecación adecuada con valores de %G ≥ 80 en todo el rango de %HR y contenidos finales de agua entre 9.8-25.1 %H (b.h), sin embargo, las semillas desecadas hasta 5 %H (b.h) disminuyeron significativamente su viabilidad (%G=66.7), confirmando que la especie C. limón cv. Eureka corresponde a una categoría intermedia. Se determinó y modeló la isoterma de sorción utilizando el modelo de D'Arcy & Watt. Las transiciones de fusión de lípidos y de agua en las semillas se analizaron utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Se analizó la performance de dos sistemas de enfriamiento en NL: i) convencional: las semillas se colocaron en crioviales de polipropileno cerrados (P1) y ii) ultrarrápido: las semillas fueron recubiertas con film de aluminio y colocadas en crioviales de polipropileno perforados (P2). Las velocidades de congelación y calentamiento fueron 1000ºC/min para P2 y 200ºC/min para P1. Para ambos protocolos el valor máximo de viabilidad (%G=83.3) se presentó en semillas con actividad acuosa aw= 0.64 que corresponde a la fracción de agua no congelada. La formación de hielo intracelular letal fue responsable de la pérdida de viabilidad a altos valores de aw. El P2 presentó una mejor performance comparado con P1 dado que las velocidades de congelación/calentamiento fueron mucho mayores logrando mantener una mayor viabilidad de las semillas. El uso de P2 permitió ampliar el rango de desecación entre 0.33