PROBIEN   20416
INSTITUTO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO EN INGENIERIA DE PROCESOS, BIOTECNOLOGIA Y ENERGIAS ALTERNATIVAS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización preliminar de dos toxinas killer para el biocontrol de levaduras contaminantes de vinos.
Autor/es:
SAEZ JULIETA SUSANA; VILLALBA MARÍA LETICIA; DEL MÓNACO SILVANA MARÍA; LÓPES CHRISTIAN ARIEL; SANGORRÍN MARCELA PAULA
Lugar:
Mendoza
Reunión:
Jornada; III Jornadas Nacionales de Biología y Biotecnología de Levaduras; 2011
Resumen:
Caracterización preliminar de dos toxinas killer para el
biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
J. S. Saez1, L. Villalba1, S. del Mónaco1, C. A. Lopes1 & M. P. Sangorrín1
1 Dpto. de Química - Fac. de Ingeniería. IDEPA (Instituto de Investigación y Desarrollo de la
Patagonia Norte), CONICET-UNCo. Buenos Aires 1400, Neuquén (8300), Neuquén, Argentina.
Email: julieta.saez@conicet.gov.ar
En nuestro laboratorio se han seleccionado dos cepas de levaduras
productoras de toxinas killer pertenecientes a las especies Torulaspora
delbrueckii (toxina TdKT) y Wickerhanomyces anomala (toxina WaKT) capaces
de combatir el desarrollo, en ensayos de laboratorio, de levaduras
contaminantes de vinos: Brettanomyces bruxellensis, Pichia guilliermondii,
Pichia manshurica y Pichia membranifaciens, todas ellas productoras de
niveles significativos de fenoles volátiles.
Las toxinas TdKT y WaKT se obtuvieron a partir del sobrenadante de un
cultivo en fase estacionaria en medio YPD, que fue precipitado con 80% de
sulfato de amonio. Para la detección de las toxinas se utilizó una cepa sensible
control de Candida glabrata, analizando los halos de inhibición del crecimiento
en medio YPD-MB-agar, el seguimiento de DO 650 en microplacas de 96
pocillos con caldo YPD y la viabilidad mediante ensayos de MTT.
Se evaluó la estabilidad de las toxinas frente a diferentes condiciones de
stress típicas de vinificación (pH, etanol, temperatura y dióxido de azufre).
Ambas fueron estables a etanol 2-16%, temperatura 0-26°C, pH 3-4,5 y SO2
25-150 ppm, resultando interesantes para su empleo en vinificación. A su vez,
las toxinas mostraron diferente especificidad frente a las levaduras
contaminantes. WaKT fue más efectiva frente a P. guilliermondii y P.
membranifaciens, mientras que TdKT lo fue frente a P. guilliermondii, P.
manshurica y B. bruxellensis.
Se determinó que la masa molecular de las dos toxinas es mayor a 30
KDa por filtración diferencial con membranas de diferente cut-off. Para conocer
el blanco primario de las toxinas se realizaron ensayos de competencia en
placas con YPD-MB-agar, con diferentes polisacáridos de la pared de
levaduras: curdulano, laminarina, manano, pustulano, pululano y quitina, como
también con la lectina ConA. El pustulano (β-1,6-glucano) logró reducir la
actividad de las dos toxinas. Adicionalmente, la lectina redujo la actividad de
TdKT, indicando que las mananoproteínas son también un blanco para la
misma.
Para conocer el modo de acción de las toxinas se utilizaron técnicas de
microscopía de fluorescencia que incluyeron tinción con Calcofluor White,
ioduro de propidio, y Hoechst 33342. Los ensayos demostraron que ambas
toxinas inducen procesos apoptóticos en las levaduras sensibles, afectando la
viabilidad celular significativamente a partir de las 24 hs.
Los resultados obtenidos permiten inferir el uso potencial de ambas toxinas
killer en enología con el fin de lograr vinos sin defectos y con menores riesgos
para la salud al disminuir la utilización de conservantes químicos.