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Los galacto-oligosacáridos (GOS) representan un grupo importante de compuestos bioactivos de reconocida capacidad prebiótica. Son carbohidratos no digeribles constituidos por moléculas de galactosa y una unidad de glucosa terminal. Se forman a partir de la lactosa por la acción de la enzima β-galactosidasa en una reacción de transgalactosilación, reacción de condensación que ocurre simultáneamente con la reacción de hidrólisis. Si bien la adición de estos compuestos en la formulación de alimentos funcionales es una práctica común, la posibilidad que los mismos se generen in situ en la matriz alimentaria constituye una potencial alternativa.El propósito del presente trabajo fue evaluar la síntesis de GOS mediante la incorporación de la enzima β-galactosidasa y la adición de bacterias probióticas, durante la elaboración de yogur y almacenamiento. Además, se analizará la influencia de la incorporación de ingredientes lácteos que contienen lactosa. Para ello se realizaron experiencias de elaboración de yogur en pequeña escala (5 litros) en las que se estudiaron diferentes variables: adición de enzima (dos niveles), adición de ingredientes lácteos (mezcla de leche en polvo descremada, proteínas de suero y pectina), e incorporación de la bacteria probiótica Lactobacillus acidophilus La-5 y de inulina. Asimismo, yogures control con ausencia de la enzima fueron preparados. Durante el proceso de elaboración (aprox. 4 h) y almacenamiento (21 días/5°C) se analizó el contenido de GOS y de lactosa por HPLC con detector de Índice de Refracción y por método enzimático, respectivamente. Se analizó la composición global (materia grasa, proteína y sólidos totales), y se realizaron recuentos de bacterias probióticas y de hongos y levaduras, a los 7 días. Los resultados obtenidos demostraron la capacidad de la enzima β-galactosidasa proveniente de K. lactis de producir GOS en la matriz láctea. La presencia de GOS se produjo a los 45 minutos de fermentación, niveles que se incrementaron hacia el final de elaboración. Durante los 21 días de almacenamiento se apreció una ligera disminución en todos los casos. La incorporación de la bacteria probiótica no produjo modificaciones sustanciales en la producción y estabilidad de los GOS. Los yogures con concentraciones incrementadas de lactosa a causa del agregado de ingredientes lácteos, alcanzaron niveles superiores de GOS que los respectivos productos sin este ingrediente. Como era previsible el contenido de lactosa disminuyó acentuadamente durante el proceso de elaboración en los yogures adicionados de la enzima en comparación con los controles sin enzima, debido a la acción hidrolítica de la misma. La presencia de la enzima no afectó la composición global de los yogures, ya que los valores obtenidos fueron adecuados para cada tipo de yogur, no observándose diferencias entre los productos con y sin probiótico. Las bacterias probióticas se encontraron en niveles de 106 UFC/ml, y el recuento de hongos y levaduras fue aceptable en todos los productos. Finalmente, se ha demostrado que la incorporación de la enzima β-galactosidasa en la producción de yogur, favorecería la generación de GOS en la matriz láctea.