Comparación de métodos de permeabilización y lisis de Streptococcus thermophilus

PERALTA, GUILLERMO; BERGAMINI CARINA V; HYNES ERICA R.

Santa Fe

Simposio; II Simposio Argentino de Lactología; 2012

Instituto de Lactología Industrial

Los métodos de lisis y permeabilización en bacterias son de gran importancia para el estudio de las enzimas intracelulares, así como para la atenuación de cultivos celulares para ser usados como biocatalizadores no viables. El objetivo de este trabajo fue estudiar diferentes métodos de lisis y permeabilización de dos cepas comerciales de Streptococcus thermophilus. Para ello se ensayaron agentes químicos: Mutanolisina 100 y 200 U/mL, Alcohol 40%, Dodecil Sulfato de Sodio 0,1% (SDS), y agentes físicos: Ultrasonido, Calor 60ºC, Congelado -80ºC y Disrupción mecánica en un disruptor celular. Como índice de efectividad del tratamiento, se realizaron recuentos en placa, y se determinó la actividad de dos enzimas intracelulares: lactato dehidrogenasa (LDH) y -galactosidasa (-GAL) para estudiar el efecto de los tratamientos en la accesibilidad de las mismas. Las enzimas se cuantificaron en las suspensiones celulares enteras (actividad total) que reflejan tanto la permeabilización como la liberación de enzimas, y en el sobrenadante libre de células (actividad liberada) que es utilizada como un índice de lisis. Los tratamientos de Alcohol y SDS provocaron una reducción del 100% de la viabilidad celular, mientras que en ambos tratamientos con mutanolisina hubo una disminución de un orden logarítmico de la población celular. La influencia de los tratamientos de Ultrasonido, Disruptor, Calor y Congelado en los recuentos celulares fue más variable, y en general se produjo una disminución de uno a dos órdenes logarítmicos. Los tratamientos con Alcohol y SDS aumentaron notablemente la actividad total de la -GAL, mientras que produjeron un mínimo incremento en la actividad -GAL liberada. El efecto del tratamiento con SDS sobre la LDH fue similar a los de la -GAL; mientras que los niveles de LDH en las muestras tratadas con Alcohol fueron bajos, lo que podría deberse a una desnaturalización de esta enzima por el tratamiento aplicado. Los niveles de las dos enzimas estudiadas aumentaron en los extractos tratados con Mutanolisina y Ultrasonido, presentando similares niveles la actividad total y liberada. El tratamiento con el disruptor celular mostró la mayor liberación de actividad -GAL, mientras que produjo un leve incremento de la LDH, lo que podría atribuirse a un efecto negativo del tratamiento sobre esta enzima. En general los métodos de Calor y Congelado no afectaron significativamente la liberación o accesibilidad de LDH y -GAL. De los resultados obtenidos se puede concluir que los tratamientos de SDS y Alcohol resultaron adecuados para obtener una permeabilización, mientras que la Mutanolisina, Ultrasonido y Disruptor celular resultaron buenos métodos de lisis. Una cuestión importante a tener en cuenta es que los diversos tratamientos de lisis o permeabilización pueden afectar de diferente manera la actividad de determinadas enzimas.