Expresión de Intrerferón omega felino en Spodoptera frugiperda

ALEXANDRA TARGOVNIK; NICOLÀS URTASUN; CASCONE OSVALDO; MARÍA VICTORIA MIRANDA

Simposio; XXX Reunión Científica de la SAV 2010; 2010

El rFeIFN consiste en una proteína de 171 aminoácidos con 6 cisteínas y un sitio de N-glicosilación en la posición 79. Se ha demostrado la eficacia del tratamiento con rFeIFN para mejorar la sintomatología y prolongar la supervivencia de los animales infectados con diversos virus felinos resultando más efectivo a largo plazo que el tratamiento con interferón alfa humano El objetivo del trabajo es obtener interferón felino a partir de cultivos celulares de Spodoptera frugiperda como plataforma para el posterior escalado en larvas autóctonas. Para la expresión del interferón felino (rFeIFN) se abordaron diferentes estrategias. Inicialmente se construyeron diferentes plásmidos de transferencia: pAcGPINF y pAcG2TINF contienen la secuencia del péptido señal de secreción de origen viral GP67 y dirigen la expresión del rFeIFN al extracelular. Además, el plásmido pAcG2TINF permite obtener una proteína de fusión a glutatión S transferasa (GST). Por otro lado se construyó un tercer plásmido pAc1393INF en el que se clonó la secuencia del rFeIFN con su péptido señal endógeno. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes por contrasfección de cada uno de los plásmidos de transferencia descriptos y el ADN viral BaculoGoldTM Brigth en células de insecto Sf9 en medio de cultivo Sf900 II 1% SFB. Luego de la recombinación homóloga entre plásmido y genoma viral se amplificó el titulo viral por sucesivos pasajes en Sf9 obteniéndose los stocks de trabajo de altos títulos como inóculos. Para la producción del rFeIFN en cultivo, se utilizó una línea celular Sf9 adaptada al medio SF900 con 1% SFB. Se estudió la cinética de expresión. Se realizaron ensayos de actividad biológica sobre una línea celular de origen felina CRFK y el virus VSV. A partir de diluciones seriadas de sobrenadantes de infección de diferentes dpi se obtuvieron los títulos de rFeIFN por dilución a punto final determinada como la mayor dilución de rFeIFN que inhibe el 50% de la acción citopática. Tras optimizar las condiciones de trabajo se logró expresar al 4° dpi 106 UI/ml en el caso de AcMNPV1393INF y 105 UI/ml con AcMNPVGPINF y AcMNPVG2TINF. Estos resultados demuestran que el péptido señal perteneciente a rFeIFN es reconocido eficientemente por el sistema células de insecto y a su vez se logran obtener mayores niveles de expresión que en los casos en que se utiliza el péptido señal de origen viral. La expresión de rFeIFN fusionado a GST no afectó su actividad biológica. Se pudo determinar por Western Blot la presencia de dímeros en condiciones no desnaturalizantes. En el caso de la proteína de fusión a GST se observó la presencia de una sola banda correspondiente a 45 kDa. Cuando se expreso la proteína sin fusionar en células de S. frugiperda se observaron dos isoformas glicosiladas afines a la Concanavalina A de 20 y 24 kDa. Por lo tanto se ha logrado expresa interferón funcional en línea celular. La experiencia obtenida, se utilizará para escalar el producto de interés en larvas autóctonas de nuestro país obteniéndose un producto original.