Tecnología integrativa aplicada a la producción de proteínas recombinantes con alto rendimiento y bajo costo.

LEVIN, G.; MAGRI, L.; LOUSTAU, M.; NAVARRO, A.; CASCONE, O.; MIRANDA, M.V.

Bs. As.

Congreso; X Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2005

Introducción. En Biotecnología, la generación de productos (o servicios) competitivos en términos de calidad y costo dependen de la disponibilidad de procesos eficiente. El costo de producción de una proteína recombinante puede disminuirse si se plantean estrategias integrando las distintas etapas del proceso: diseño de la secuencia codificante, selección del vector y el sistema de expresión, localización del producto, el medio, las condiciones de producción y el esquema de purificación para lograr un producto con el grado de pureza y rendimiento adecuado para su aplicación. Es decir que se debe vincular de manera óptima las etapas tempranas del proceso (upstream) y las de purificación (downstream) especialmente en aquellos casos en que se planea un escalado del mismo. El sistema de expresión en baculovirus/células de insecto es ideal para la expresión de altos niveles de proteína recombinante de naturaleza eucariota. Respecto a las etapas de downstream, la aplicación de tecnologías integrativas permiten reducir el número de pasos dentro de un proceso de purificación mejorando el rendimiento y el costo. La cromatografía en lecho fluidizado y clasificado (EBA) integra la eliminación de la biomasa (clarificación) con la concentración y la purificación en un solo paso. El propósito de este trabajo es desarrollar un modelo de proceso integrativo de expresión-purificación de proteínas recombinantes buscando optimizar de manera cruzada completa el proceso de producción desde el gen al producto. Concretamente el objetivo fue modificar el punto isoeléctrico (PI) de peroxidasa (HRP) –como proteína modelo- por fusión con cola de argininas de manera de lograr su purificación directa a partir del medio de expresión por cromatografía de intercambio iónico disminuyendo el costo global de producción. Materiales y Métodos. Se clonó el gen de interés bajo el promotor de poliedrina y tras una secuencia de secreción en un vector de expresión de baculovirus. Se expresó HRP6xarg en distintas líneas celulares de Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21 y en larvas de Rachiplusia nu. Los cultivos celulares fueron infectados con baculovirus recombinante a factor de multiplicidad 2. Al momento de infección se agregó al medio de cultivo hemina 2,4 mM.  Se cosechó el sobrenadante de cultivo al 6º día postinfección. Las larvas de 4º estadio fueron infectadas con 10 ml de inóculo (6.107 ufp/ml. Los medios de expresión se acondicionaron a pH 8,5 y se sembraron en columnas empacadas (S-Sepharose) y en lecho fluidizado (SP-Streamline). En ambos casos, la elución se llevó a cabo con NaCl 1M. Resultados y Discusión. Se obtuvo peroxidasa de alto PI (9,5) en las dos líneas celulares pero con distintos niveles de expresión (Sf9: 6,02 U/ml; Sf21:16,02 U/ml). HRP6xarg se expresó a niveles de 5 mg/larva en hemolinfa al 3º día post-infección. Se purificó el producto en cromatografía convencional con un rendimiento superior al 98% y un factor de purificación de 130. En EBA se obtuvo la enzima con un nivel de pureza similar pero con menor rendimiento (50%). Los resultados obtenidos demuestran la utilidad de la estrategia planteada como modelo de proceso de expresión y purificación directa de proteínas recombinantes de alto PI.