Desarrollo de un proceso para la producción de peroxidasa recombinante en larvas de insecto

MARÍA LOUSTAU; GUSTAVO LEVIN; LUCIA ROMERO; OSVALDO CASCONE; MARÍA VICTORIA MIRANDA

Bs. As.

Congreso; Biolatina2006; 2006

Foro Argentino de Biotecnología

La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una enzima cuyo principal mercado deriva de su aplicación en métodos diagnósticos inmunológicos. Su fuente tradicional es la raíz de Armoracia rusticana, cultivo que no abunda en nuestro país y por lo tanto toda la peroxidasa debe importarse. El objetivo de este trabajo es la optimización de un proceso de expresión-purificación de HRP en larvas de Rachiplusia nu infectadas con baculovirus recombinante. La construcción viral (AcMNPVHRP) contiene una secuencia que codifica para HRP con 2 tags (6xhis y 6xarg) que se encuentra bajo el control del promotor de poliedrina viral. Se infectaron larvas de estadío 4 por vía subcutánea con 1,5.106 partículas virales. Se recolectó la hemolinfa  y se prepararon extractos totales del 1º al 4º día postinfección (dpi) en un buffer que previene la melanización. El 3º dpi resultó óptimo para la recolección de muestras ya que para el 4º dpi aumentaba también la mortandad de las larvas. Los geles de SDS PAGE e IEF teñidos con 3,3´diaminobenzidina mostraron una banda de PM 44 kDa y alto punto isoleléctrico (9,5). El producto de expresión se purificó por IMAC e intercambio iónico. En ambos casos se obtuvieron altos rendimientos de HRP (87-89 %). El sistema de baculovirus-R. nu resultó eficiente para la expresión de altos niveles de HRP activa (115.9 ± 8.2 mg/kg) y a bajo costo.