Infección oral de larvas de insecto con baculovirus recombinante para la producción masiva de proteínas.

ROMERO L.; LÒPEZ MG; KONING G.; LEVIN G.; NAVARRO DEL CAÑIZO A.; TABOGA O.; CASCONE O.; MIRANDA MV.

La Rural CABA Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial.; 2007

INTRODUCCION Y OBJETIVO: La utilización de larvas de lepidópteros como biofábricas permite obtener altos niveles de proteínas recombinantes a bajo costo. Las larvas de Rachiplusia nu son susceptibles a la infección con el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV), pudiéndose infectar inyectando virus brotado en hemolinfa o por alimentación con poliedros. El sitio blanco de inserción del gen foráneo más comúnmente utilizado es el locus poliedrina. Durante la infección esta proteína se expresa mayoritariamente, y forma una malla proteica, denominada “poliedro”, que embebe a los viriones protegiéndolos de las radiaciones y la desecación. Como resultado del reemplazo alélico de este gen los baculovirus recombinantes con fenotipo occ- se caracterizan por no ocluirse en una matriz de poliedrina. Estos virus no ocluídos presentan una baja eficiencia de infección por vía oral en larvas de insecto, siendo ésta menos laboriosa cuando se cuenta con un gran número de insectos. El objetivo de este trabajo fue obtener poliedros mixtos para la infección oral de R. nu y producción de peroxidasa recombinante de Armoracia rusticana (HRP) en hemolinfa como proteína modelo.  MATERIALES Y METODOS: Se coinfectaron monocapas de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) (aprox. 7 x 105 cel/pocillo) con virus AcMNPV salvaje/ AcMNPV HRP+occ- a multiplicidades de infección (MOIs) 1:1; 1:5; 1:10; 2:2; 2:10 y 2:20. Al 4º día postinfección (dpil) se colectaron las células. Los poliedros fueron purificados y cuantificados en una cámara de Neubauer a partir del lisado celular. Larvas de R. nu del 4º estadío criadas individualmente a 23-25ºC fueron infectadas con una dosis de 1 x 106 pol/100 mg de dieta artificial. Al 4º dpi se recolectó hemolinfa determinándose la actividad de HRP por un método cinético con guayacol como sustrato. La población viral tanto salvaje como recombinante fue cuantificada por Real Time PCR (RT-PCR), utilizando oligonucleótidos diseñados especialmente en el laboratorio. RESULTADOS: Comparando el nivel de expresión de poliedrina vs. peroxidasa obtenido puede estimarse que la población de virus salvaje es similar a la población de virus recombinante (SDS-PAGE). Sin embargo, el análisis por RT-PCR de los poliedros obtenidos con MOI 2:10 y 2:20 demuestran que la población recombinante es superior a la salvaje en dos órdenes de magnitud. A su vez se observa que la población de virus recombinante fue un orden de magnitud mayor en las relaciones de MOI 2:10 que en las 2:20. Esto último se refleja en la concentración de HRP recombinante alcanzada en ambas condiciones: 34,7 U/ml para MOI 2:10 y 32,2 U/ml para MOI 2:20. La relación virus salvaje/virus recombinante 2:10 resultó ser la más apropiada para obtener altos recuentos de poliedros y  la máxima expresión de la proteína de interés en larvas. CONCLUSIONES: Durante la coinfección a alta MOI, tanto el virus salvaje como el virus recombinante resultan co-ocluídos. Este procedimiento debe repetirse cada vez que se requiera infectar larvas de insectos ya que altas MOI favorecen rearreglos, deleciones y otras variantes que podrían afectar el producto final. Los poliedros mixtos sirvieron como inóculo para infectar eficientemente larvas por vía oral. La enzima mostró tener el mismo PM y pI que la obtenida por infección intrahemocele con virus recombinante occ-. Por último, este esquema de trabajo puede aplicarse para la producción de otras proteínas de interés para la industria.