Biofábricas: Caracterización de peroxidasa recombinante expresada en larvas de Lepidópteros.

LOUSTAU M; LEVIN G.; ROMERO L.; NAVARRO DEL CAÑIZO A.; MIRANDA MV; CASCONE O.

La Rural, CABA Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial.; 2007

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: En Biotecnología, es fundamental el desarrollo de tecnologías que involucren procesos con alto rendimiento y bajo costo, lo que se logra generalmente por reducción del número de pasos. La expresión de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros infectados con baculovirus genéticamente ingenierizados permite la obtención de proteínas de interés comercial que requieran modificaciones postraduccionales. Se tomó como proteína modelo la peroxidasa de rábano picante (HRP) cuya fuente es la raíz de Armoracia rusticana. Esta enzima de uso frecuente en laboratorios clínicos, se emplea en ensayos de diagnóstico y es de origen importado. La misma está altamente glicosilada, posee cuatro puentes disulfuro y un grupo prostético hemo. Por estas características estructurales la HRP sólo puede ser expresada en sistemas eucariotas. En el presente trabajo se describe un método para la expresión y purificación de HRP en larvas de Rachiplusia nu. MATERIALES Y MÉTODOS: Se empleó una construcción genética conteniendo cDNA del gen de HRP, flanqueado por una cola de poli-His en el extremo N y una cola de poli-Arg en el extremo C. Se infectaron larvas del último estadío de R. nu con 50 ml de una solución stock de virus recombinante AcMNPVHRP de alto título (3,3 x 107 pfu ml-1). Inmediatamente fueron alimentadas con una dieta artificial a base de soja y mantenidas a 24ºC. Se recolectó hemolinfa y se realizaron los homogenatos (extracto total) al 3 día postinfección (dpi), empleando un buffer de fosfatos de sodio 0,05 M, pH 6,0, EDTA 5 mM, KCl 0,15 M con agregado de cristales de glutatión y posterior centrifugación de ambas muestras a 10000 x g durante 10 minutos. Se determinó la actividad enzimática de HRP por un método cinético empleando guayacol como sustrato. Se analizó el producto de expresión por electroforesis en geles en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes, por isoelectroenfoque (IEF) y por Western Blot (WB). Se purificó el producto por cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) en una columna Ni HisTrap de 1 ml de volumen de lecho equilibrada con un buffer de fosfatos de sodio 25 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM. Se trabajó a un flujo de 0,5 ml min-1 y se eluyó la enzima por agregado de imidazol 250 mM. RESULTADOS: La cinética de expresión mostró un pico al 3º día postinfección. La concentración de HRP en hemolinfa y en extracto total fue de  288,2±17,9 mg L-1 y 115,9±8,2 mg kg-1 respectivamente. No se observó una banda con actividad de peroxidasa en larvas sin infectar. Se evaluó el punto isoeléctrico (pI) mediante el ensayo de IEF comparando con un estándar de HRP (Sigma), observando que la enzima recombinante posee un pI de 9,5 (superior al del estándar). También se determino el peso molecular (44 kDa) de la proteína recombinante mediante SDS-PAGE y WB demostrando que el mismo es semejante al del estándar, indicando una similitud en el nivel de glicosilación. En IMAC se logró una recuperación de 89,2% con un factor de purificación de 13,2. CONCLUSIONES: De acuerdo con los resultados, se puede afirmar que el sistema de expresión baculovirus – larvas de R. nu resulta eficiente para la expresión de altos niveles de HRP. Este sistema permite obtener altas concentraciones de proteína activa y homogénea en un solo paso cromatográfico y a bajo costo de producción.