INVESTIGADORES
MIRANDA Maria Victoria
congresos y reuniones científicas
Título:
Utilización del sistema baculovirus para la expresión in vivo e in vitro de peroxidasa recombinante.
Autor/es:
TARGOVNIK A.; ROMERO L.; LEVIN G.; TABOGA O.; CASCONE O.; MIRANDA MV.
Lugar:
CABA Argentina
Reunión:
Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008
Resumen:
La utilización de células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes constituye una interesante estrategia biotecnológica para la expresión de proteínas recombinantes de interés comercial. En este sistema, la producción masiva de proteínas puede lograrse infectando grandes volúmenes de cultivo de líneas celulares comerciales (in vitro) o bien empleando directamente las larvas de Lepidóptero (in vivo). El objetivo del presente trabajo fue estudiar la expresión de la isoenzima C de peroxidasa de Armoracia rusticana (HRP C) aplicando ambos esquemas de producción en la misma especie de Lepidóptero, Spodoptera frugiperda. HRP C es una hemoproteína con actividad de oxidorreductasa cuyo principal uso comercial deriva de su utilización como insumo en la fabricación de kits de diagnóstico médico. Se construyó un baculovirus (AcMNPV) recombinante por cotransfección del plásmido de transferencia pAcHRPNPV y el ADN viral BaculoGoldTM Brigth en células de insecto Sf9 en medio de cultivo Sf900 II 1% v/v SFB (suero fetal bovino). El plásmido de transferencia contiene el ADNc de HRP C bajo el promotor de poliedrina y río abajo y en fase con la secuencia del péptido señal GP67. Luego de la recombinación homóloga entre plásmido y genoma viral se amplificó el titulo viral por sucesivos pasajes en Sf9. El stock de trabajo alcanzó un título de  9,2x107 ufp/ml y sirvió de inóculo para expresar la HRPr tanto in vitro como in vivo. Expresión in vitro: Se infectaron cultivos en monocapa y en suspensión con 1X106 células/ml, crecidas a 28ºC en medio Sf900 II conteniendo 1 % v/v SFB con baculovirus recombinante HRPC a  multiplicidad de infección (MOI)  0,5, 1, 2 y 5 con o sin el agregado de hemina. Durante los siguientes 6 días post infección (pi) se realizó la cosecha del sobrenadante y se evaluó la actividad enzimática de la enzima. Expresión in vivo: Por otra parte, larvas de Spodoptera frugiperda del 5º estadio fueron infectadas con el mismo baculovirus. Para la inoculación, las larvas fueron anestesiadas por inmersión en un baño de agua helada durante 10 min y se inyectaron con 50 ml de suspensión viral de título 105, 106 y 107. Luego de una hora post-infección las larvas fueron llevadas al cuarto de cría (25ºC) y alimentadas con una dieta artificial. Se obtuvo extracto al día 3 y 4 pi por homogeneización de las larvas para evaluar el contenido de HRP. Tras optimizar las condiciones de trabajo (MOI:2 y medio de cultivo suplementado con 7,2 µM de hemina) se logró expresar 11,6 mg/l en sobrenadantes de cultivos en suspensión a los 5 dpi representando la proteína de interés el 1,05 % de las proteínas totales presentes en el medio. Cuando se infectaron larvas de S. frugiperda con 50 µl de un virus con un título viral de 106 ufp/ml se logró un máximo de expresión de 41,6 µg HRPr/larva o 130 mg HRPr/Kg al día 4 pi. Esto representó el 0,32 % de las proteínas totales presentes en el huésped. El inóculo viral necesario para infectar 1L de cultivo de células, es suficiente para infectar 40000 larvas y producir 143 veces más masa de enzima recombinante. En conclusión, los resultados de este trabajo permitieron comparar la producción de HRPr in vivo vs in vitro utilizando la misma especie de Lepidóptero (Spodoptera frugiperda) como huésped de expresión. La utilización de larvas como biofábricas demostró ser la opción más conveniente en términos económicos. Los resultados aquí presentados pueden derivar en el desarrollo de una plataforma tecnológica para producir proteínas de interés comercial en general y en particular, para sustituir importaciones de este biocatalizador.