INVESTIGADORES
MIRANDA Maria Victoria
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de neuraminidasa recombinante del virus influenza A
Autor/es:
LAURA FALETTI; NICOLÀS URTASUN; ALEXANDRA TARGOVNIK; GUSTAVO LEVIN; MARÍA VICTORIA MIRANDA
Reunión:
Congreso; ETIF, 7° Congreso y Exposición para la producción farmacéutica, biotecnológica y veterinaria,; 2012
Resumen:
Las vacunas actuales contra la influenza están preparadas con virus inactivados producidos en cultivo en huevos de gallina embrionados. Frente a una pandemia, una alternativa para la producción rápida y masiva de vacunas es la expresión recombinante de los principales antígenos virales. Las proteínas antigénicas del virus de influenza se localizan en su envoltura y están sujetas a variaciones periódicas que hacen necesario el ajuste constante de las preparaciones vacunales. Una de ellas, la neuraminidasa (NA) es un homotetrámero glicosilado de ~240 kDa cuyos monómeros forman dímeros mediante puentes disulfuro. Los anticuerpos anti-NA restringen la diseminación del virus y actúan disminuyendo la severidad de los síntomas de la enfermedad. En el presente trabajo, se estudió la expresión de dos variantes de la NA (con y sin dominio transmembrana, con-Tm y sin-Tm respectivamente) proveniente de la cepa viral Influenza A H1N1 en células de insecto (Sf9) y larvas de lepidópteros (Rachiplusia nu). Los monómeros de ambas variantes de NA presentaron el peso molecular esperado de aproximadamente 60 kDa. Los ensayos de actividad biológica a través del tiempo indicaron que la NA con-Tm se localizó en su mayoría en el medio intracelular, mas específicamente unida a la membrana luego de realizar ensayos de inmunofluorescencia. Al cuarto día post infección, el 39 % del total de la NA con-Tm producida se secretó al medio de cultivo registrándose en el mismo la actividad máxima. El rendimiento en lisados celulares fue de 9,97 ± 0,74 mg/l de cultivo y en sobrenadantes de cultivo de 6,57 ± 0,51 mg/l. La NA sin-Tm se secretó al medio de cultivo en un 80%. La actividad biológica medida para esta variante fue baja en lisados celulares incrementando en el sobrenadante a lo largo del tiempo, sin embargo, esta resultó 5 veces menor comparada con la actividad de la NA con-Tm. El rendimiento fue de 0,72 ± 0,12 mg/l en lisados celulares y 1,95 ± 0,057mg/l en el sobrenadante. La producción de NA con-Tm en larvas de R. nu fue de 1,2 ± 0,197 mg/g de larva. Además, pudo ser parcialmente purificada a través de una cromatografía de pseudoafinidad usando concanavalina A como ligando. Por lo tanto, para producir 1 mg de NA con-Tm recombinante son necesarios 153 ml de cultivo de células en suspensión o seis larvas. El antígeno NA pudo ser expresado eficientemente en células y larvas de insecto conservando su forma biológicamente activa. La eliminación del dominio transmembrana resultó una estrategia que promovió la secreción de NA al medio de cultivo pero estaría afectando la estabilidad de la estructura cuaternaria de la proteína. Hemos demostrado que R. nu es capaz de producir altos niveles de NA recombinante biológicamente activa. El uso de larvas como ?biofábricas? es una alternativa interesante para la producción de los antígenos del virus de influenza debido a su bajo costo y elevado rendimiento en comparación con el proceso en cultivo celular.