INVESTIGADORES
MIRANDA Maria Victoria
congresos y reuniones científicas
Título:
Purificación de peroxidasa recombinante expresada en larvas de Lepidópteros por partición en sistemas de dos fases acuosas.
Autor/es:
TARGOVNIK A; ROMERO L.; LÓPEZ MG.; MARANI M.; LEVIN G.; LOUSTAU M.; TABOGA O.; CASCONE O.; MIRANDA MV.
Lugar:
La Rural, CABA Argentina
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial.; 2007
Resumen:
Introducción y Objetivo: La expresión de una proteína en el sistema baculovirus-células de insecto puede llevarse adelante utilizando una línea celular desarrollada en monocapa o cultivos en suspensión (in vitro), o alternativamente por infección de la larva del insecto en un estadío tardío dentro de su ciclo biológico (in vivo). Cada tipo de proceso presenta ventajas y desventajas, lo que hace necesario hacer una evaluación en cada caso antes de tomar una determinación acerca de cuál es el sistema más conveniente. La isoenzima C de peroxidasa de Armoracia rusticana (HRP) es una hemoproteína que consiste estructuralmente en una cadena polipeptídica glicosilada en ocho sitios específicos, con 4 puentes disulfuro, un grupo prostético conformado por un grupo hemo (Fe protoporfirina IX) y dos átomos de calcio. Estas características estructurales complican su expresión en forma activa en sistemas procariotas. Por otra parte, los sistemas de dos fases acuosas constituyen una tecnología que permite en un solo paso integrar operaciones como clarificación, concentración, fraccionamiento grosero y purificación dentro de un proceso clásico de downstream processing.   El objetivo de este trabajo fue recuperar la HRP recombinante expresada en la línea celular y en larvas de Spodoptera frugiperda en sistemas de dos fases acuosas. Materiales y Métodos: Se infectaron cultivos de 4,7. 105 células Sf9 (línea celular de Spodoptera frugiperda )/ml, crecidas a 27ºC en medio Grace´s conteniendo 10 % v/v de suero fetal bovino (SFB) con baculovirus recombinante HRPC a multiplicidad de infección (MOI) 2. Por otra parte, larvas de Spodoptera frugiperda del 5º estadio fueron infectadas con el mismo baculovirus. Para la inoculación, las larvas fueron anestesiadas por inmersión en un baño de agua helada durante 10 min y se inyectaron con 50 ml de suspensión viral de alto título (@107 pfu/ml) vía subcutánea. Luego de una hora post-inyección las larvas fueron  llevadas al cuarto de cría y alimentadas con una dieta artificial. Se determinó el comportamiento de partición de la enzima y las proteínas contaminantes en sistemas de dos fases PEG/fosfatos. Se utilizó PEG de distintos pesos moleculares: 600, 1000, 1540, 4000 y 6000, a pH 7, en presencia y ausencia de NaCl. Resultados: Para la expresión in vitro, con PEG 600 la HRP particionó totalmente a la fase superior, mientras que con PEG 6000 su constante de partición (KHRP) fue de 0,2. Por otra parte, las proteínas totales mostraron constantes de partición (KPT) de 8,4 y 0,4 respectivamente. Con PEG 1000 la KHRP fue de 0,9, pasando de particionar mayoritariamente de la fase superior a la inferior. Los restos celulares se concentraron en la interfase del sistema. Para la expresión in vivo, la enzima también particionó totalmente a la fase superior en PEG 600, mientras que su K fue de 0,015 en PEG 4000. El PM del PEG también influyó sobre la KPT (6,7 en PEG 600 y 0,24 en PEG 4000). La KHRP en estos mismos sistemas en presencia de 0,7 moles/Kg de NaCl se incrementó en todo el rango ensayado. Conclusiones: El análisis de los resultados obtenidos permitió diseñar un esquema de purificación de HRP en dos etapas a partir del sistema de expresión en larvas. Dicho sistema consiste en PEG 1540 (15,9 %P/P)/fosfatos pH 7,0 (11,9 %P/P) con NaCl 0,7 moles/Kg, 7,6 %P/P de larvas. Se logró unificar los pasos de clarificación del extracto y extracción de la enzima en un primer paso y la fase superior se usó en un segundo paso donde finalmente se logró un rendimiento del 87% y un factor de purificación de 2.