ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE LACTOFERRICINA BOVINA RECOMBINANTE EN EL SISTEMA BACULOVIRUS/CÉLULAS DE INSECTOS.

NICOLÀS URTASUN; CASCONE, OSVALDO; WOLMAN FEDERICO; MIRANDA MARÍA VICTORIA

Congreso; X Congreso de Virología; 2011

La lactoferricina bovina (LfcnB) es un péptido catiónico de peso molecular 3124 Da que deriva de la fracción Phe17-Phe41 del extremo amino de la lactoferrina bovina y constituye un potente antimicrobiano frente a diferentes microorganismos que incluyen bacterias y hongos, y además exhibe mayor potencia bactericida que la Lfcn humana, murina y caprina. La LfcnB se obtiene por digestión con pepsina de la lactoferrina bovina. La obtención de LfcnB recombinante en E. coli se complica debido a la actividad antibacteriana del péptido. El objetivo de este trabajo fue estudiar la expresión de LfcnB recombinante en el sistema baculovirus/células de insecto. Se trabajó con el gen sintético de LfcnB. Se diseñaron diferentes sets de primers con los que se amplificó la secuencia de LfcnB por PCR y se clonó luego en diferentes plásmidos de transferencia dando lugar a las siguientes construcciones: pVL1393-LfcnB, pAcGP67B-LfcnB, pAcG2T-LfcnB y pAcSecG2T-LfcnB. Se obtuvieron cuatro baculovirus recombinantes por cotransfección de cada una de las construcciones mencionadas con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) utilizando la línea celular l Sf9 en medio de cultivo Sf900 II suplementado con 1% de suero fetal bovino (SFB). En todos los casos, la expresión del gen de LfcnB está dirigida por el promotor de poliedrina viral. El título viral se amplificó a partir del sobrenadante de cultivo por sucesivos pasajes en células Sf9 hasta lograr stocks de trabajo de alto título los cuales fueron utilizados para infectar cultivos celulares. Se desarrolló en el laboratorio un ELISA competitivo utilizando un anticuerpo monoclonal para LfcnB. Se optimizó la determinación y se cuantificaron los niveles de expresión de LfcnB en diferentes experimentos. Cuando se infectaron células Sf9 con AcMNPV-LfcnB, el máximo nivel de expresión intracelular fue de 246 ± 23 µg/l de cultivo (1,5.109 células por litro) al 3er día. Por otra parte, cuando el péptido LfcnB fue liberado al medio de cultivo utilizando el baculovirus AcMNPV-GP67B-LfcnB, el nivel máximo de expresión alcanzado fue de 163 ± 30 µg/l de cultivo (1,5.109 células por litro) al 6to día. Cuando se infectó con el baculovirus AcMNPV-G2T, el máximo nivel de expresión intracelular de LfcnB fusionada a glutatión S transferasa se registró al 3er día, siendo la concentración de LfcnB de 1,2 ± 0,4 mg/l (1,5.109 células por litro). En el caso en que se utilizó el baculovirus AcMNPV-SecG2T el máximo nivel de expresión de la proteína de fusión fue de aprox. 0,8 ± 0,4 mg/l de LfcnB en el medio de cultivo al 5to día. En conclusión, la mejor estrategia resultó ser la expresión intracelular en líneas celulares de LfcnB fusionada a una proteína partner.