SISTEMA MULTIPLEX EN PCR EN TIEMPO REAL SEGUIDO DE DESNATURALIZACIÓN TÉRMICA PARA CUANTIFICAR, DETERMINAR SEXO Y ESTIMAR NIVEL DE DEGRADACIÓN DE ADN HUMANO EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

GINART SANTIAGO; A. SALA

San Pablo

Jornada; XXIV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades Grupo Montevideo; 2016

Asociación de Universidades Grupo Montevideo

La cuantificación de ADN humano resulta un paso clave para alcanzar el éxito en la amplificación de marcadores genéticos utilizados en identificación humana o en diagnóstico molecular. Para el trabajo con evidencias forenses o restos antiguos es importante además poder inferir por un lado, el sexo del donante y por otro, el nivel de degradación del material genético extraído. El presente trabajo propone el desarrollo y validación de un sistema de PCR en tiempo real que amplifica cuatro fragmentos distintos que permiten, en forma simultánea, la medición del nivel de degradación del material genético presente en una muestra, detección de ADN masculino y cuantificación de ADN total.A una reacción previamente desarrollada en nuestro laboratorio, se incorporaron dos pares de iniciadores que permiten la amplificación de amplicones de longitud diferente (152 y 244 pares de bases, respectivamente) para reflejar, mediante el análisis de curvas de desnaturalización térmica, el nivel de degradación del material genético estudiado. El proceso se realiza en presencia de un colorante intercalar que permite visualizar el progreso de la reacción. El sistema cuádruplex desarrollado funciona dentro de un rango de concentración de ADN humano de 0,030 - 54 ng/ul con buena linealidad, es decir, permite trabajar con muestras de ADN dentro de un rango amplio de concentraciones, para el estudio de muestras tanto de interés forense (baja concentración) como aquellas asociadas al campo de diagnóstico clínico y genética de poblaciones. Este desarrollo ha sido diseñado con reactivos de bajo costo, complementando técnicas más sofisticadas ofrecidas comercialmente. Es específica, sensible, rápida y provee una herramienta muy valiosa para el análisis de ADN extraído, orientando hacia una adecuada estrategia de amplificación de polimorfismos genéticos.