Presencia de cadherina epitelial en espermatozoides de toro: estudios de inmunolocalización en diferentes estadios funcionales de la gameta

CABALLERO J; CÉTICA P; DALVIT G; VAZQUEZ-LEVIN MH

Cordoba, Argentina

Congreso; VI Simposio Internacional de Reproducción Animal; 2005

RED IRAC-BIOGEN

 La cadherina epitelial (cad-E) es una glicoproteína de adhesión que participa en la unión célula-célula en numerosos sistemas. Estudios de nuestro grupo han descripto previamente la presencia de cad-E en espermatozoides de hombre y ratón, en regiones asociadas a su interacción con células oviductales así como con el ovocito. Asimismo, evidencias preliminares sugieren la participación de cad-E en fecundación. Entonces, Cad-E podría proponerse como marcador espermático de capacidad fecundante. El objetivo del estudio fue determinar la presencia y localización de cad-E en espermatozoides de toro en diferentes estadios funcionales de la gameta. Se evaluaron muestras de semen previamente congeladas (pajuelas de 0,5 ml) provenientes de 5 toros Holando Argentino de fertilidad probada del centro de inseminación CIAVT (Venado Tuerto, Sta Fe). Las muestras fueron descongeladas y procesadas, removiendo la solución crioprotectora y seleccionando la fracción mótil por filtración en columnas de lana de vidrio. Luego, los espermatozoides fueron incubados en un medio capacitante con Heparina (60 mg/ml), por 45 min a 38,5ºC, seguido de incubación por 15 min en medio conteniendo lisofosfatidil colina (LPC, 100 mg/ml), inductor de la reacción acrosómica. En todas las condiciones experimentales, se evaluó la motilidad, vigor, estado de capacitación/reacción acrosomal (técnica de Cloro TetraCiclina; CTC) e integridad del acrosoma (tinción con Pisum Sativum aglutitina, PSA). La localización de cad-E se determinó por inmunocitoquímica sobre espermatozoides con un anticuerpo específico anti cad-E (Sta Cruz Biotech, cat # SC7870). Las muestras de semen descongeladas presentaron una concentración espermática de 22-38 millones/ml, con un alto porcentaje de células mótiles luego del decongelamiento (58-68% células mótiles progresivas), con un vigor 3-4 (escala 0-5; máximo=5). El procedimiento de filtración en columnas de lana de vidrio permitió la recuperación de un alto porcentaje de células mótiles (85-95%; vigor 3-4), y con el acrosoma intacto (>95%; tinción con PSA) en todos los casos; la tinción con CTC reveló la presencia de un alto porcentaje de espermatozoides clasificados como no capacitados (Patrón F=61-85%). Luego de la incubación en medio capacitante, se observó un alto porcentaje de células capacitadas (Patrón B=58-61%) según el ensayo de CTC. Luego de la incubación con LPC, se observó una tasa de reacción acrosómica (D) del 13-35% (D=total menos basal). En inmunocitoquímica, un alto % de espermatozoides mostraron una señal fuerte y específica para cad-E en el reborde apical del acrosoma, y una tinción de menor intensidad en el capuchón acrosomal y región post-acrosomal (patrón P6: 83, 86, 83, 77, 75%). En espermatozoides capacitados, el patrón predominante (P3: 52-94%) mantuvo una señal intensa en el reborde apical y en la región postacrosomal, no observándose tinción acrosomal. Los espermatozoides reaccionados (colocalización con PSA) mostraron una señal para cad-E que sugeriría su localización en la membrana acrosomal interna (P6´: 27-52% células reaccionadas); asimismo, se observaron presencia de cad-E en región postacrosomal (P1) y segmento ecuatorial (P4´). En conclusión, Cad-E se encuentra presente en espermatozoides bovinos en distintos estadios relacionados a su funcionalidad (no capacitados, capacitados y reaccionados), encontrándose localizada en regiones que participarían en la interacción con células del oviducto y con las estructuras acelulares y celulares que rodean al ovocito. Estudios futuros evaluarán su rol en la fecundación y su uso como marcador funcional.