Técnicas moleculares basadas en PCR para el estudio de hongos en alimentos: Detección de hongos aflatoxicogénicos en cereales y oleaginosas

MARIA MARTA REYNOSO; RAMIREZ, M. L.; CHULZE , S.N

Manual de Métodos Moleculares en Microbiología

Eudonne /Corpus

Lugar: Misiones; Año: 2011; p. 182 - 183

La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) es un método poderoso con amplias aplicaciones en la biología molecular. Dicha técnica tiene varias aplicaciones en micología, incluyendo genética y sistemática fúngica, ecología y microbiología de suelo, patología vegetal, micología médica, biotecnología fúngica y muchas otras. Debido a que la mayoría de los patógenos fúngicos son difíciles de identificar en base sólo a las características morfológicas, y que la identificación morfológica consume demasiado tiempo y requiere de conocimiento previo en taxonomía, es que las técnicas basadas en PCR se han convertido en una herramienta poderosa para el diagnóstico rápido de hongos fitopatógenos y micotoxicogénicos. Para la detección de hongos fitopatógenos y micotoxicogénicos, la elección de los métodos de extracción de ADN depende del tipo de muestra. Para la identificación de un patógeno a partir de cultivos puros, en la mayoría de los casos, es posible obtener ADN templado de calidad usando métodos tradicionales que implican la lisis de las células y  la solubilización del ADN seguido de la remoción de contaminantes (proteínas, ARN y otras moléculas) a través de métodos enzimáticos o químicos. En cambio, la detección del patógeno a partir de tejidos, suelo, aire o agua, requiere de procedimientos de extracción de ADN más complejos a fin de eliminar ciertos inhibidores presentes en dichas muestras. Con este propósito, en la última década, se ha incrementado el uso de kits comerciales para el aislamiento y purificación de ADN: kits que usan columnas de intercambio iónico,  otros basados en la unión del ADN a perlas de vidrio, entre otros. Dichos métodos, tienen la ventaja de que son más rápidos y se requiere menos experiencia. La extracción de ADN usando el método de CTAB (Bromuro de cetiltrimetilamonio) fue utilizado inicialmente en bacterias (1) y más tarde modificado para extraer ADN a partir de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (2, 3). Se pueden usar varios tipos de tejido vegetal, incluyendo hojas, cotiledones, semillas, granos, endospermas, embriones, polen, raíz, etc. El material puede ser liofilizado, deshidratado, congelado o fresco. En nuestro laboratorio hemos usado satisfactoriamente este protocolo para la extracción de ADN a partir de maíz (granos), trigo (granos) y maní (granos, raíz, tallo, hojas). El CTAB forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos cuando la concentración inicial de NaCl es menor a 0.5 M (3). Los polisacáridos, compuestos fenólicos y otros inhibidores que se encuentran en plantas son removidos eficientemente en el sobrenadante porque la mayoría no precipita bajo las condiciones descriptas. El complejo ácido nucleicos–CTAB es soluble en altas concentraciones de sal; el detergente es removido lavando el NaCl y precipitando con isopropanol o etanol. Los residuos de CTAB son removidos lavando los ácidos nucleicos con etanol al 70%; el CTAB es más soluble en etanol y es descartado con la solución de lavado. El protocolo que se describe a continuación se aplica a una amplia variedad de materiales vegetales, aunque tienen una aplicación importante en cereales (maíz) y oleaginosas (maní). Dicho protocolo es relativamente simple, rápido y fácil y se requiere solo miligramos o gramos de tejido.