Caracterización del rol de la ARN-metiltransferasa TGS1-like en la transición desde la sexualidad a la apomixis en Paspalum notatum

COLONO, CAROLINA; SIENA, LORENA; ORTIZ, JUAN PABLO AMELIO; LEBLANC, OLIVIER; SOUZA CANADA, DANIEL; PERMINGEAT, HUGO; PESSINO, SILVINA

Bahía Blanca

Simposio; XI Simposio Nacional de Biotecnología; 2017

REDBIO ARGENTINA

La apomixis origina semillas que contienen embriones clonales formados en ausencia de meiosis y fertilización. Previamente identificamos un parálogo del gen TGS1 (trimethyl guanosyl synthase-1) (TGS1-like), cuya expresión en óvulos de Paspalum notatum se correlaciona negativamente con la expresividad de la apomixis. En levaduras y animales, TGS1 actúa en la biogénesis de la maquinaria de clivado y empalme (splicing) y como coactivador transcripcional. La eliminación de su función produce pérdida de la estructura nucleolar y deficiencias en el procesamiento de pre-rARNs y mARNs, que conlleva a alteraciones fenotípicas tales como defectos del crecimiento en condiciones de frío y fallas en la meiosis y la embriogénesis. Nuestro objetivo es estudiar el rol de TGS1-like en la transición sexualidad-apomixis. La hipótesis de trabajo es que en los óvulos de plantas apomícticas aparecen variantes de splicing específicas debido a la inactivación de TGS1-like. A partir de bibliotecas florales de RNAseq de plantas apomícticas y sexuales seleccionamos los 316 transcriptos con expresión diferencial más probable (FDR < 6,74 E-10). Determinamos que 20 correspondían a posibles variantes de clivado y empalme. Seis de ellos fueron seleccionados para estudiar su expresión en 4 plantas apomícticas y 4 sexuales. Se diseñaron oligonucleótidos específicos complementarios a las secuencias intrónicas, y se utilizaron en experimentos de RT-qPCR para detectar las variantes no procesadas. Se confirmó un splicing alternativo ligado al modo de reproducción para un gen que codifica la proteína LHCA1, un módulo de unión a membrana asociado en Arabidopsis con la división especializada durante el desarrollo de estomas, tricomas y células de la epidermis de la raíz. Además, se identificaron 24 transcriptos relacionados con la función de splicing que presentan expresión diferencial en las bibliotecas 454/Roche. Para estudiar la relación causa-efecto entre la actividad disminuida de TGS1-like y la aparición de variantes de splicing transformamos el genotipo híbrido sexual CSEX-1 de P. notatum con una construcción que contiene 733 pb de TGS1-like clonados en orientación antisentido en un vector pAct1-gfbsd2 (pAct1-F1as). Callos indiferenciados originados de semillas maduras fueron bombardeados con partículas de tungsteno que portaban pAct1-F1as + pUbi-BAR-p35S-GFP, usando una equipo biolístico BIOMICS. Se realizaron tres experimentos, que involucraron 10 placas con 15 callos cada una, además de controles de regeneración y selección. La transformación estable de siete eventos fue demostrada por amplificación por PCR usando cebadores específicos para la construcción antisentido. El trabajo aquí presentado nos permitió: 1) identificar un gen que se procesa de manera específica durante el desarrollo apomíctico (PN_LHCA); 2) reconocer otros miembros de la maquinaria de splicing alterados en plantas apomícticas; 3) generar herramientas para estudiar el rol de TGS1-like en los procesos de splicing y analizar las consecuencias reproductivas de la disminución de su expresión.