Transformación biolística de Paspalum notatum tetraploide con un gen candidato para la apomixis

MANCINI M; WOITOVICH N; PERMINGEAT H; ORTIZ JPA; QUARIN C; FELITTI S; PESSINO S

Zavalla

Taller; III Ciclo de seminarios sobre avances en la caracterización genética y molecular de la apomixis en gramíneas forrajeras; 2012

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario

En trabajos previos, nuestro grupo identificó 65 genes diferencialmente expresados en genotipos sexuales y apomícticos de Paspalum notatum. Uno de estos genes (código experimental N46) resultó homólogo a MAP3Ks. Fue aislado del genotipo sexual y su secuencia mapeó in silico en el genoma de arroz en una región sinténica con la región genómica que controla la aposporía en P. notatum. El objetivo de nuestro trabajo fue caracterizar la secuencia y la expresión del gen candidato N46 y desarrollar una plataforma de transformación para modificar su expresión en órganos reproductivos de plantas apomícticas y sexuales. Se utilizó la técnica de RACE para aislar la secuencia codificante completa (1390 nucleótidos), que en los análisis de Blastx arrojó la mayor similitud con un gen de maíz con anotación MAP3K (E-value: 0.0, % ID: 96%). Los experimentos de hibridización in situ de tejidos reproductivos indicaron que la hebra sentido del transcripto se expresa en óvulos inmaduros de la planta apomíctica, y la antisentido en planta sexual. Los experimentos de PCR en tiempo real confirmaron una expresión diferencial en plantas apomícticas y sexuales en estadío meiótico. Para iniciar los experimentos de transformación, se desarrolló un sistema de cultivo de tejidos sobre el genotipo Q4117 (tetraploide apomíctico), ensayando tres tipos de explantos: embriones maduros, meristemas de vástagos y semillas maduras. Los porcentajes de regeneración obtenidos fueron similares en los tres casos (~45%), por lo que se eligió trabajar con semillas maduras. Los experimentos de transformación transiente fueron realizados utilizando un acelerador de partículas de tungsteno, presiones de helio comprimido de 600, 800 y 1100 psi, y vectores de transformación con genes de la vía de antocianinas o EGFP (green fluorescent protein), clonados bajo el promotor constitutivo act1 de arroz. Se establecieron curvas de selección con el herbicida glufosinato de amonio y el antibiótico kanamicina. Los experimentos de transformación estable se realizaron utilizando una mezcla de dos plásmidos en cantidades equimolares, uno de ellos con una construcción en horquilla del gen N46 (MAP3K) bajo el protomor act1 de arroz, junto con el selector bar (tolerancia a glufosinato de amonio), y el otro con GFP clonado bajo el promotor act1. El porcentaje de regeneración obtenido fue de 71 plantas regenerantes/600 callos bombardeados. La introducción de los transgenes fue analizada por PCR, obteniéndose los siguientes resultados: 23.3% gfp, 3,3% bar, 30% co-transformación (bar + gfp) y 26.7% escapes. Actualmente se están realizando experimentos de Southern Blot para confirmar la integración de los transgenes al genoma. Además los fenotipos de las inflorescencias de las plantas transgénicas están siendo analizadas y se encontró expresión de gfp en polen de plantas reportadas como gfp positivas según los experimentos de PCR.