EXTRACCIÓN CON SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS EN COMBINACIÓN CON CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN MOLECULAR COMO MÉTODO ALTERNATIVO PARA PURIFICAR TOXINAS OFÍDICAS.

GOMEZ, GABRIELA; NERLI, BIBIANA; ACOSTA, OFELIA; PICÓ, GUILLERMO; LEIVA, LAURA

Rosario

Simposio; 1er Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos.; 2010

Laboratorio de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación Rosario.

Introdución: Los venenos ofídicos se consideran fuentes ricas en polipéptidos y proteínas farmacológicamente activos. Algunos componentes tienen actividades enzimáticas del tipo proteinasa, fosfolipasa A2, nucleotidasa, etc, responsables de sus efectos neurotóxicos, miotóxicos y hemorrágicos, entre otros. La mordedura por serpientes u ofidios puede causar alteraciones leves o graves en la salud de la víctima, inclusive su muerte, dependiendo del tipo de lesión y del sitio de exposición, así como del tamaño y especie del animal. Dentro de las especies peligrosas, la Bothrops alternatus se halla muy difundida en el nordeste de nuestro país y países limítrofes y resulta causante del mayor número de muertes por accidente ofídico en América. El conocimiento de la composición de los venenos y el aislamiento de algunas de sus toxinas pueden contribuir a la producción de sueros antiofídicos más específicos y eficaces. Los métodos convencionales del aislamiento de toxinas ofídicas son costosos y prolongados ya que comprenden una compleja secuencia de cromatografías, siendo la de intercambio iónico, en fase reversa y de alta presión las más utilizadas. La extracción líquido-líquido con sistemas bifásicos acuosos (SBAs) se muestra como una metodología alternativa, que ha sido empleada en la purificación de diversas biomoléculas a partir de mezclas complejas. Presenta ventajas tales como su bajo costo, simplicidad y posibilidad de escalado. Al presente no existen antecedentes de haber empleado esta técnica en el aislamiento de toxinas ofídicas. Metodología: Un pool de venenos provenientes de especies adultas de Bothrops alternatus pertenecientes al Serpentario de Corrientes, fue liofilizado y mantenido a -20 °C para su conservación. Previo a su utilización fue redisuelto en PBS pH 7,2 hasta una concentración proteica final de 50mg/mL.  Las experiencias de reparto se llevaron a cabo empleando sistemas bifásicos acuosos preparados con un polímero de cadena flexible, polietilenglicol (PEG) de peso molecular 3350 y fosfato de potasio (Pi) pH 7,0. La composición final del SBA fue 12,3-13,7 y 74,0 % P/P de Pi, PEG y agua respectivamente. Una cantidad adecuada del veneno reconstituído (500 mL) fue sembrada sobre un SBA formado con 5 mL de cada fase. Alcanzado el equilibrio de reparto, la fase superior fue removida y reemplazada por fase superior limpia, de modo de realizar un nuevo paso extractivo. Este procedimiento se repitió un total de cuatro veces. El último paso de purificación se realizó mediante cromatografía de filtración en gel, aplicando el extracto correspondiente a la fase inferior del último reparto sobre una columna (1 cm x 95cm)  cargada con Sephadex G-75. La elución fue realizada con solución PBS pH 5. El seguimiento del proceso de purificación fue realizado midiendo las actividades proteolítica y fosfolipasa A2, y el contenido de proteínas totales en el material de partida y extractos correspondientes a pasos extractivos intermedios y finales. La pureza de las muestras fue también evaluada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Resultados: El análisis de las actividades fosfolipasa A2 y proteolítica en muestras provenientes de la fase superior e inferior de los diferentes repartos ensayados evidenció una distribución preferencial de toxinas con estas actividades hacia la fase inferior rica en sal. Esa tendencia se fue acentuando en los sucesivos pasos extractivos, sugiriendo cambios en el comportamiento de reparto que podrían atribuirse a la heterogeneidad de las fracciones proteicas que conforman el veneno. El análisis de la SDS-PAGE (Figura 1) mostró la presencia de tres bandas principales en el veneno crudo: una ancha compatible con proteínas de pesos  moleculares en el rango 50-60 kDa y dos bandas delgadas correspondientes a pesos moleculares de 25 y 28 kDa respectivamente. Luego de los cuatro pasos extractivos, el extracto correspondiente a la fase inferior solo evidenció dos bandas delgadas correspondientes a pesos moleculares de 59 y 25 kDa compatibles, de acuerdo a la literatura, con proteinasas y fosfolipasas A2 respectivamente. El fraccionamiento del extracto final mediante una columna de Sephadex G-75 permitió resolver satisfactoriamente la muestra en dos picos (Figura 2) con actividad proteolítica y fosfolipasa A2. La pureza de las proteínas aisladas fue evidenciada por SDS-PAGE por la presencia de una única banda en cada caso. El rendimiento global del proceso calculado para cada toxina fue próximo al 5 %, valor pequeño que no difiere significativamente del obtenido con los métodos convencionales de purificación.