Optimización de las condiciones separativas de tripsinógeno y quimotripsinógeno en sistemas bifásicos acuosos

PELLEGRINI, L.; BIBIANA BEATRIZ NERLI; PICÓ, G.

Rosario

Congreso; Congreso. XXVI Runión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2006

Sociedad de Biología de Rosario

En estudios previos caracterizamos el perfil de reparto de tripsinógeno (TRPz) y quimotripsinógeno (QTRP) en sistemas bifásicos acuosos (SBAs) no tradicionales. El SBA formado por  polietilenglicol (PEG) de peso molecular 1450 y citrato de sodio (NaCit) pH 8,2 demostró tener propiedades adecuadas para ser potencialmente aplicable a la separación de ambos zimógenos. En el presente trabajo se buscó optimizar el proceso separativo mediante la manipulación de variables tales como el número de pasos extractivos y relación de volúmenes de fase con la finalidad de aplicar los resultados a la purificación de tripsina, forma enzimáticamente activa, de alto valor comercial, a partir de páncreas bovino. Se repartieron mezclas de TRPz y QTRPz en SBAs PEG1450/NaCit pH 8,2 con composiciones correspondientes a dos líneas de unión diferentes del respectivo diagrama binodial. Se ensayaron distintas relaciones de volumen de fase. Se agregó un segundo paso extractivo reemplazando la fase superior del primer reparto por igual volumen de dicha fase limpia. La cuantificación de TRPz en ambas fases fue realizada por un método específico que comprende dos etapas: i) la activación cuantitativa del TRPz a tripsina y ii) la determinación de la actividad enzimática de la tripsina formada mediante un sustrato cromogénico. El incremento de la relación de volúmenes de fase, R (R = Vsuperior/Vinferior) desde 1 a 4 incrementó los valores de pureza del TRPz obtenido en la fase inferior desde 66 a 84 %. Valores de R mayores a 4 no modificaron sensiblemente los resultados mientras que valores menores a 1 disminuyeron drásticamente la pureza del TRPz en la fase inferior. La alternativa de aumentar el número de extracciones (n) también mostró ser muy eficaz para obtener una proteína con alto grado de pureza alcanzándose valores de hasta 92 %. Ambas estrategias  (incremento de R y n) fueron acompañadas por una significativa pérdida de rendimiento (desde 56 al 34 %), que en nuestro caso no representa una desventaja significativa, ya que el páncreas bovino, potencial fuente de obtención de la  enzima, es un abundante y económico subproducto de la industria frigorífica local. Finalmente, los altos valores de pureza obtenidos sumados a la ventajosa biodegradabilidad del anión citrato y a la facilidad del escalado, permitirían que estos sistemas no tradicionales formados por polietilenglicol y citrato de sodio puedan formar parte en un futuro de protocolos de purificación industrial. *Becaria de la Fundación Nuevo Banco de Santa Fe. Concurso “Ideas-Proyecto” 2005/6