INVESTIGADORES
NERLI Bibiana Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
PURIFICACIÓN DE TRIPSINÓGENO A PARTIR DE PÁNCREAS BOVINO MEDIANTE COMBINACIÓN DE REPARTO EN SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS Y PRECIPITACIÓN CON POLÍMEROS DE CADENA FLEXIBLE.
Autor/es:
PELLEGRINI MALPIEDI, LUCIANA; ROMANINI DIANA; NERLI BIBIANA; PICÓ GUILLERMO
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial. Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial (JorFyBI).; 2007
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial
Resumen:
Cantidades crecientes de tripsina son requeridas para satisfacer las necesidades de las industrias farmacéuticas y alimentarias. El objetivo de este trabajo es optimizar las condiciones que permitan purificar tripsinógeno (TRPz), precursor inactivo de la tripsina, a partir de páncreas bovino, aplicando un método escalable: la extracción líquido-líquido con sistemas bifásicos acuosos (SBAs). En un trabajo previo, demostramos que los sistemas formados por polietilenglicol de peso molecular 1450 (PEG1450) y citrato de sodio pH  8,2 (Nacit) mostraban la mayor capacidad para aislar TRPz a partir de homogenado pancreático [1]. El TRPz se reparte hacia la fase rica en citrato mientras que las otras proteínas se reparten hacia la fase rica en PEG. En este trabajo se analizaron otras variables como la longitud de la línea de unión (LLU), la concentración de la biomasa y el cociente de volúmenes de fase (Vr = VSup / VInf). Se ensayó un paso de precipitación con un polímero cargado eléctricamente de forma de mejorar el proceso de purificación. Seleccionamos polietilenimina (PEI), un polímero de cadena flexible cargado positivamente que tiene la posibilidad de precipitar moléculas cargadas negativamente como los ácidos nucleicos y proteínas ácidas [2]. Se ensayaron diferentes concentraciones finales de PEI (0.10; 0.25 y  0.50 % p/p).  La efectividad del proceso de precipitación fue evaluada midiendo el cociente de absorbancias a 260 y 280 nm y el contenido de TRPz. Una concentración final de PEI del 0,25 % permitió remover el 55% de los ácidos nucleicos sin una significativa pérdida del contenido de TRPz. El sobrenadante obtenido resultó claro, prácticamente libre de partículas insolubles provenientes de la ruptura tisular y con una viscosidad suficientemente baja que facilitaron el procesamiento subsecuente. Una concentración de PEI superior resultó inconveniente ya que produjo una significativa precipitación tanto de los ácidos nucleicos como del tripsinógeno. Cantidades crecientes de ese sobrenadante (hasta un 5, 7,5 y 10 % de la masa total del sistema respectivamente) se repartieron en SBAs con diferentes composiciones y relación de volúmenes. Los sistemas de mayor LLU mostraron mayores rendimientos ( R) y factores de purificación (FP) de TRPz que los de LLU menores. El incremento de la cantidad de sobrenadante sembrado produjo incremento en el rendimiento de TRPz desde 50 al 90 % y una disminución en el factor de purificación desde 3,7 a 2,5. Por otro lado la reducción de Vr hasta 0,5 produjo un incremento en el FP hasta 4,6 con un rendimiento del 84 %. Nuestros resultados muestran que la precipitación selectiva con PEI seguida por una extracción líquido-líquido con SBAs PEG/Cit  resultan en una estrategia conveniente para purificar TRPz a partir de homogenado pancreático. Esta metodología presenta las siguientes ventajas: a) fácil escalado, b) bajo costo de materiales, c) el reciclado del polímero y d) la biodegradabilidad del anión citrato.   ______________ [1] G. Tubio; L. Pellegrini; D. Romanini; B. Nerli; G. Picó. An Improving Method for Purifying a Protease of High Commercial Value, the Bovine Pancreatic Trypsin. Congress Food Science and Food Biotechnology in Devleoping Countries. Saltillo. México. 2006. [2] BW De Walt; JC Murphy; GE Fox; RC Willson. Compaction agent clarification of microbial lysates. Compaction agent clarification of microbial lysates. Protein Expr. Purif. 28 (2003) 220-223.