Evaluación de la estabilidad estructural y funcional de dos fitoproteasas cisteínicas, papaína y bromelina, en presencia de diferentes polietilenglicoles.

ROCHA, M. VICTORIA; ENSINCK, DELFINA; LIVIERI, ANDREA; NERLI, BIBIANA

Rosario

Congreso; Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica.; 2013

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica.

Introducción: Papaína (PAP) y bromelina (BR) son cisteíno proteasas de origen vegetal con múltiples usos industriales. Su aislamiento por metodologías convencionales requiere de una precipitación selectiva seguida de diversos pasos cromatográficos. En nuestro laboratorio estamos desarrollando métodos de purificación alternativos más simples, económicos y escalables para recuperar PAP y BR a partir de sus fuentes naturales. Estos métodos están basados en principios de: -reparto entre fases inmiscibles acuosas y -afinidad por macroligandos, y utilizan polímeros de cadena flexible como el polietilenglicol (PEG). Objetivo: Evaluar el efecto de la presencia de PEGs de diferentes pesos moleculares (600, 1000, 2000, 4600 y 8000) sobre el estado conformacional y funcional de PAP y BR con el fin de validar el uso de estos polímeros en estrategias de recuperación de las proteasas mencionadas. Resultados: Se analizó el efecto del polímero sobre: -la emisión de fluorescencia nativa de ambas proteínas (lexc 280 nm), -estructura secundaria y terciaria a través de dicroísmo circular (DC) en el UV lejano y cercano respectivamente y -medidas de actividad en el tiempo y a diferentes temperaturas frente a sustratos específicos. Además, se caracterizó termodinámicamente el equilibrio de reparto de BR y PAP en sistemas bifásicos acuosos formados por diferentes PEGs y citrato de sodio pH 5,2 con el fin de identificar las fuerzas involucradas en la transferencia de las mencionadas enzimas a una fase rica en PEG. Se observó que los PEGs de mayor tamaño (2000, 4600 y 8000) no afectan la posición y la intensidad de la señal fluorescente ni el patrón observado en los espectros de DC de BR y PAP. Ambas enzimas mostraron retener su actividad (valor no inferior al 80 % respecto del medido en ausencia de polímero) al menos durante 3hs. y frente a temperaturas de hasta 60°C. Los PEGs de menor tamaño (600, 1000) causaron perturbaciones significativas en los espectros de emisión de fluorescencia (corrimientos al azul de hasta 8 nm) y en los espectros de DC de ambas fitoproteasas, pero sólo afectaron la funcionalidad de BR, observándose una drástica pérdida de actividad hasta un 30 % del valor sin polímero. Este comportamiento se correlacionaría con interacciones disimiles de BR y PAP frente a los PEGs mencionados. Cambios entálpicos y entrópicos negativos (-8 kcal/mol y -20 cal/Kmol) medidos para la transferencia BR a fases ricas en PEG sugieren una interacción electrostática, mientras que cambios positivos para ambos parámetros (2 kcal/mol y 8 cal/Kmol) obtenidos para PAP indican una interacción de tipo hidrofóbico. Conclusiones: Los PEGs de peso molecular (PM) 2000, 4600 y 8000 no modifican estructural y funcionalmente a PAP y BR, siendo viable su empleo en estrategias de purificación. Los PEGs de PM 600 y 1000 inducen cambios en estructura secundaria y terciaria próxima a aminoácidos aromáticos de ambas fitoproteasas pero sólo en el caso de BR se reflejan en una drástica perdida de actividad enzimática, haciendo desaconsejable su utilización en procesos de recuperación de esta enzima.