INVESTIGADORES
NERLI Bibiana Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
Aplicabilidad de los sistemas bifásicos acuosos de polietilenglicol/citrato de sodio para la obtención de proteasas pancreáticas.
Autor/es:
PELLEGRINI LUCIANA; TUBÍO GISELA; NERLI BIBIANA; PICÓ GUILLERMO
Lugar:
Buenos Aires ARGENTINA
Reunión:
Jornada; Octavas Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial (JorFyBI); 2005
Resumen:
Introducción y Objetivos El 70-80 % del costo total de la obtención de biomoléculas de uso farmacológico tales como insulina, alfa 1 antitripsina, etc. corresponde a la etapa de aislamiento y purificación de la molécula de interés a partir de su fuente natural o del producto proveniente de un organismo genéticamente modificado. En los últimos años se viene empleando en forma creciente un método basado en el principio de partición líquido-líquido en sistemas bifásicos acuosos (SBA). Estos SBAs tienen la ventaja de poder ser aplicados a gran escala y poseer una elevada relación rendimiento/costo. El objetivo de este trabajo fue evaluar la aplicabilidad de los SBAs formados por un polímero de cadena flexible, el polietilenglicol (PEG) y el citrato de sodio (Cit) para el aislamiento de la tripsina pancreática. Esta proteasa se utiliza en la industria farmacéutica para potenciar ciertos medicamentos y en Biología Molecular para la secuenciación y clivaje de proteínas de fusión. Por otro lado, los sistemas PEG/Cit tienen ventajas comparativas respecto de otros SBAs como la biodegradabilidad y la no toxicidad del Cit. Materiales y Métodos Se estudió el comportamiento de reparto de la proteína de interés, tripsina (TRP), su principal contaminante en páncreas, la quimotripsina (QTRP) y sus respectivos precursores enzimáticos: tripsinógeno (TRPz) y quimotripsinógeno (QTRPz). Se emplearon SBAs formados por PEGs de distintos pesos moleculares: 1450, 3350 y 8000. Se analizó el efecto del pH del medio (5.2 y 8.2), la longitud de la línea de unión y la temperatura ( 20 y 40 °C) sobre el coeficiente de reparto (Kr) de las proteasas. La capacidad separativa (b) de los distintos SBAs empleados fue evaluada a través del cociente de los respectivos Krs. Resultados Se observó un comportamiento diferencial entre el reparto de TRP y QTRP y el de sus respectivos zimógenos  El equilibrio de reparto de la TRP está más desplazado hacia la fase rica en polímero que el de la QTRP para la mayoría de los SBAs mientras que al comparar el comportamiento de TRPz y QTRPz se observó el efecto inverso. El aumento del peso molecular del PEG produjo una disminución de Kr para todas las proteínas debido a un efecto de exclusión por tamaño. El SBA formado con PEG3350 demostró tener le mejor capacidad separativa (b = 3.5) para TRPz y QTRPz mientras que el formado por PEG8000 hizo lo propio para TRP y QTRP (b = 2.5).  El pH no mostró tener un efecto significativo en la capacidad selectiva de los SBAs. El incremento de la longitud de la línea de unión produjo una disminución de Kr de aquellas proteínas cuyas Kr  resultaron menores a 1 y un incremento para aquellas con Kr mayores a la unidad. El reparto de los precursores enzimáticos mostró ser más sensible a esta última variable. Conclusiones Los resultados obtenidos demostraron la gran sensibilidad de los SBAs PEG/Cit a los cambios conformacionales (área superficial expuesta) de las proteínas que se reparten. La elección adecuada de variables tales como peso molecular de PEG y composición del SBA (longitud de la línea de unión) permiten direccionar la proteína de interés hacia una de las fases y su contaminante hacia la fase contraria. Los SBAs  empleados demostraron tener mejor capacidad separativa para los zimógenos que para sus derivados enzimáticos, sugiriendo que la estrategia más adecuada para la obtención de TRP es el aislamiento de su precursor seguido de su posterior activación.