INVESTIGADORES
NERLI Bibiana Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
. Caracterización del reparto de cisteíno proteasas vegetales en sistemas bifásicos acuosos sustentables
Autor/es:
ROCHA, M. VICTORIA; NERLI, BIBIANA
Lugar:
La Plata
Reunión:
Simposio; 2do Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos; 2012
Resumen:
Introducción: Papaína (PAP) y bromelina (BR) son cisteíno proteasas de origen vegetal con múltiples aplicaciones industriales. La PAP es utilizada como mejorador de carnes en el proceso de ablandamiento y aclaramiento. Su uso se extiende en áreas farmacéuticas y cosméticas ya que se incorpora en cremas de desmanchado de piel y en soluciones de lavado de lentes de contacto. La BR se emplea también como ablandador de carnes, para hidrolizar proteínas solubles de la cerveza, evitando la turbidez y en la fabricación del pan. Ambas enzimas se extraen a partir del látex/tallo/fruto de diversas especies pertenecientes a las familias Caricaceae y Bromeliaceae mediante precipitación con sales, solventes, seguida de pasos cromatográficos que consumen tiempo y resultan costosos. La extracción con sistemas bifásicos acuosos (SBAs) es una operación unitaria integradora sencilla y económica que ha permitido la purificación exitosa de diferentes biomoléculas. El objetivo de este trabajo fue estudiar las variables que afectan el equilibrio de reparto de estas enzimas en SBAs formados por polietilenglicol (PEG) y una sal de anión biodegradable, citrato de sodio (NaCit), como paso preliminar a su extracción desde los respectivos extractos crudos. Adicionalmente se analizó el efecto de ciertas propiedades superficiales de las proteínas en estudio de modo de lograr una comprensión racional de las interacciones involucradas en el proceso de reparto. Metodología: Se emplearon SBAs formados por NaCit pH 5,20 y PEGs de distintos pesos moleculares: 600, 1000, 2000, 4600 y 8000. Para cada sistema se ensayaron dos composiciones totales correspondientes a diferentes líneas de unión del respectivo diagrama binodial. Se empleó papaína proveniente del látex de Carica papaya y bromelina, de tallo de Ananas comosus. Los coeficientes de reparto de BR y PAP (KrBR y KrPAP) se obtuvieron por medidas de actividad específica en cada fase. También se analizaron la hidrofobicidad superficial proteica (HS) y el grado de exposición de triptofanos. Estas propiedades fueron calculadas con algoritmos específicos a partir de la estructura tridimensional de cada enzima, tomada de bancos de datos públicos (NCBI) ya que trabajos previos con otras proteínas mostraron buena correlación entre ciertas características superficiales y las propiedades de reparto. Resultados y conclusión: Se observó que la actividad enzimática de PAP y BR no se ve afectada en presencia de los componentes de fase (polímero-sal), pre-requisito para el empleo de esta estrategia extractiva. A pesar de la gran similitud entre los pesos moleculares ( 30000) y los puntos isoeléctricos ( 9,60) de BR y PAP, ambas enzimas mostraron perfiles de reparto diferentes. En todos los sistemas ensayados se obtuvieron valores de KrBR superiores a los KrPAP. Se observó una tendencia de BR a repartirse hacia la fase polimérica (KrBR>1), pudiéndose recuperar el 80 % de la proteína sembrada en la fase polimérica del sistema formado con PEG de peso molecular 600. PAP exhibió un comportamiento de reparto no unilateral con Krs comprendidas entre 0,3 y 0,9 en todos los sistemas. El aumento del tamaño del PEG indujo un desplazamiento del equilibrio de reparto hacia la fase salina en ambas proteínas. BR se mostró más sensible a este factor disminuyendo hasta 12 veces su coeficiente de reparto, probablemente debido a un efecto de exclusión estérica. El incremento en las concentraciones de polímero y sal provocó efectos contrapuestos en PAP y BR: una disminución de KrPAP y un incremento de KrBR marcando para cada proteína una tendencia a repartirse hacia la fase más afín. La significativa sensibilidad del equilibrio de reparto de BR ante las variables del sistema, evidencia la factibilidad de manipular dichas variables en forma racional para el diseño, en un futuro, de un protocolo de purificación extractivo, siendo esto más dificultoso para PAP. Finalmente, se compararon los valores de Krs medidos con los calculados de HS y grado de exposición de triptofanos en cada enzima. El área expuesta por los triptofanos en la BR (353 Å2), sensiblemente superior al caso de PAP (194 Å2), se muestra como una característica decisiva en el mecanismo de reparto debido probablemente a la capacidad que el anillo pirrólico tiene de interaccionar con las moléculas del polietilenglicol.