Detección de TLR2 y TLR4 mediante Real Time RT-PCR en un modelo experimental de infección con Trypanosoma cruzi

PAROLI A F; CARRERA-SILVA EA. AROCENA AA CANO RR GEA S S.

Ascochinga

Congreso; XXIV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

Sociedad Argentina de Protozoología

La respuesta inmune innata mediada por TLRs juega un rol central en la patogénesis de la enfermedad de Chagas. Estudios previos por PCR convencional demostraron una aumentada expresión del ARNm de TLR2 en corazón de ratones C57BL/6 (B6). Sin embargo, el tejido hepático de la misma cepa presentó una disminución de los ARNm de TLR2 y TLR4 con respecto a BALB/c durante el período agudo de la infección. Por otro lado, en el hígado de BALB/c los transcriptos de TLR2 y TLR4 se incrementaron. La expresión diferencial de estos ARNm en el hígado de ambas cepas podría indicar una asociación entre la señal dada por estos receptores y un desbalance de citocinas proinflamatorias.  El objetivo de este trabajo fue la optimización de un protocolo de RT-PCR en tiempo real para la cuantificación relativa de los transcriptos de TLR2 y TLR4 en una cinética de hígado y corazón durante el período agudo de la infección con T. cruzi. Los tejidos de ratones normales e infectados con 1000 parásitos i.p., se recolectaron a los 14 y 21 dpi y el ARN se extrajo con TRIReagent. Las concentraciones óptimas de SYBR Green, ROX, cebadores y ADNc se determinaron empíricamente. La master mix casera permitió cuantificar la expresión relativa de los PRRs respecto al gen endógeno GADPH y reveló en hígado de BALB/c una regulación positiva de hasta 46 veces para TLR2 a los 14 dpi y de 9,6 veces a los 21 dpi. En C57BL/6, el aumento del ARNm de TLR2 a los 14 dpi fue de 3,4 veces y no se observó variación a los 21 dpi. BALB/c mostró una cinética similar para TLR4 aumentando 31 veces a los 14 dpi y 14,4 veces a los 21 dpi. Por el contrario en B6, TLR4 se mostró regulado negativamente en el orden de 5,5 veces a los 14 dpi y 2,7 veces a los 21 dpi. En el tejido cardíaco de la cepa BALB/c, el ARNm de TLR2 se incrementó significativamente alcanzando su pico a los 21 d.p.i., mientras que TLR4 no mostró variaciones en su nivel de expresión. Por otra parte, la cepa B6 mostró un mayor nivel de inducción de TLR2 en tejido cardíaco respecto a BALB/c, alcanzando su máximo a los 14 d.p.i. y manteniéndose elevado a los 21 d.p.i. Además, en ratones B6 a los 14 y 21 d.p.i., los transcriptos de TLR4 se incrementaron al doble respecto de los normales en este tejido. La comparación de ambos grupos nos permite observar una diferencia marcada en la regulación de TRL2 y TLR4 a todos los tiempos post-infección sugiriendo que la cepa BALB/c monta una respuesta inmune innata a la infección con T. cruzi más exacerbada en hígado con respecto a B6. Sin embargo, al comparar la expresión génica de estos receptores en el tejido cardíaco de BALB/c y B6, se observó que la infección con T. cruzi indujo una mayor expresión de los transcriptos de TLR2 en las dos cepas de ratones a los 14 y 21 d.p.i., aunque ésta fue mayor en B6. Por otro lado, el nivel de expresión de TLR4 sólo se indujo en la cepa B6.