Desarrollo de un método para determinar metabolitos volátiles del fruto del tomate por HS-SPME-GC/MS

PABLO R. CORTINA, RAMÓN ASÍS Y ANA N. SANTIAGO

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química y 4to. Workshop de Química Medicinal; 2010

  Desarrollo de un método para determinar metabolitos volátiles del fruto del tomate por HS-SPME-GC/MS. Pablo R. Cortina, Ramón Asís1 y Ana N. Santiago. Instituto de Investigaciones en Físico Química de Córdoba (INFIQC), Departamento de Química Orgánica, 1 Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI) Departamento de Bioquímica. Clínica. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba (5000), Argentina. e-mail: pcortina@fcq.unc.edu.ar Introducción El fruto del tomate (Lycopersicon esculentum) es uno de los alimentos de gran importancia nutricional en la dieta cotidiana, ofreciendo un gran aporte de minerales, vitaminas y antioxidantes. Desde hace muchas décadas se ha hecho énfasis continuamente en tratar de mejorar ciertas cualidades del tomate, una de ellas es el aumento de la calidad organoléptica del mismo, más específicamente su aroma.1 Los compuestos químicos responsables de producir esta característica en su mayoría corresponden a productos del metabolismo de la planta, como por ejemplo alcoholes, aldehídos, esteres, terpenos y cetonas derivados de diferentes vías metabólicas. Se han reportado hasta la fecha aproximadamente 400 metabolitos volátiles, de los cuales muy pocos de ellos se sabe con certeza que están involucrados en la generación del aroma característico.1,2 Las diferencias en el metabolismo de frutos entre diferentes variedades de tomate son reflejo de la variabilidad a nivel genético. A su vez estas diferencias específicamente en la composición de volátiles pueden ser percibidas como cambios en el aroma de los frutos. En el presente trabajo se propone optimizar un método para analizar la composición de compuestos orgánicos volátiles (VOC´s) entre las distintas variedades de tomate.. Metodología: La metodología de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS) es una de las herramientas más robustas para la generación de perfiles metabólicos en plantas y frutos. Debido a la gran complejidad de la matriz original, la escasa cantidad de metabolitos volátiles presentes y la amplia naturaleza química, se ha optado por una metodología de extracción centrada en la técnica de microextracción en fase sólida en espacio en cabeza o head space (HS-SPME). Esta técnica es utilizada porque permite extraer una amplia gama de VOC´s de una forma sencilla, económica, rápida y es compatible con un equipo de GC/MS. En base a esto, fue posible desarrollar un protocolo de análisis. Resultados: A partir de un pool de frutos comerciales se extrajeron más de 40 metabolitos y se identificaron por MS. Luego se modificaron los parámetros de análisis buscando obtener las condiciones óptimas del protocolo de análisis. Se realizaron 3 a 4 repeticiones para cada uno de los ensayos. Por la gran diversidad de VOC´s que se encuentran en la matriz, solo se graficarán 3-metil-1-butanol, 1-penten-3-ona, 3-hexenal, hexanal, benzaldehído, 2-heptenal, 6-metil-5-hepten-2-ona, para evaluar los parámetros determinados. Para lograr disminuir cambios en el perfil de VOC´s debido a reacciones enzimáticas y no enzimáticas, se procedió a determinar los parámetros involucrados en la disminución de la actividad metabólica del fruto. Para ello, se evaluó el efecto de sales de calcio, CaCl2, en diferentes concentraciones, sabiendo que tiene influencia en la actividad catalítica de enzimas involucradas en el metabolismo de los ácidos grasos.3 A su vez también se comprobó la eficacia del agregado de soluciones de ácido etilen diamin tetraacético (EDTA) como acomplejante de cationes que forman parte de algunas metaloenzimas,2 como por ej. alcohol deshidrogenasa (Zinc). A partir de los ensayos realizados en diferentes condiciones (Fig. 1) se definió la cantidad de 1.5 g de CaCl2 y de modo similar se determinó el agregado de 1 mL de solución EDTA 100 mM a la muestra como las mejores condiciones que permiten mantener la muestra sin alteraciones. Figura 1: Metabolitos volátiles de tomate frente a diferentes concentraciones de CaCl2. Figura 1: Metabolitos volátiles de tomate frente a diferentes concentraciones de CaCl2. A su vez, se evaluaron de forma similar los parámetros que tienen incidencia en el proceso de extracción de los VOC´s, por parte de la técnica de SPME como el tipo de fibra, efecto de la temperatura y tiempo de extracción. Figura 2: Metabolitos volátiles de tomate utilizando diferentes tipos de fibras de SPME. MHO: 6-metil-5-hepten-2-ona. Figura 2: Metabolitos volátiles de tomate utilizando diferentes tipos de fibras de SPME. MHO: 6-metil-5-hepten-2-ona. Se realizó la extracción de VOC´s con diferentes tipos de fibra de SPME, DVB/CAR/PDMS; CAR/PDMS; PDMS/DVB, siendo la que posee las tres fases absorbentes la que ofrece resultados mas eficientes. Luego las muestras fueron extraídas a diferentes temperaturas utilizando la fibra de DVB/CAR/PDMS, pudiéndose obtener a 50°C la mejor extracción de los analitos. Una vez determinada la temperatura óptima, se realizó el mismo proceso a diferentes tiempos en donde se obtuvo 40 minutos como el mejor tiempo de extracción. Todos los parámetros presentados fueron obtenidos trabajando de forma manual, a su vez se compararon estas condiciones en forma automática, utilizando un equipo Combi-PAL (CTC Analytics) para SPME. Obteniéndose solo una pequeña diferencia en el tiempo y temperatura de extracción, siendo 35 minutos y 45°C las condiciones optimas de extracción, probablemente debido a diferencias en la agitación y el calentamiento más controlado. Luego de la optimización de todos los parámetros de análisis, se procedió a obtener una medida de la dispersión que ofrece el método. Se realizaron 3 a 4 repeticiones de una misma muestra en forma manual y automática. El coeficiente de variación porcentual (CV %) de los 40 metabolitos analitos identificados varía entre un 8-30%. Siendo la dispersión total del método en su forma automática de 14% y manual del 23%. Conclusiones El desarrollo del método de extracción-análisis de los metabolitos volátiles del fruto de tomate por la técnica de HS-SPME-GC/MS permitió optimizar los parámetros que ofrecen los mejores resultados tanto en la estabilización de la muestra como en el proceso de extracción de los analitos de la matriz, en su forma manual como automática. A su vez, fue posible obtener una metodología de análisis con una dispersión aceptable y capaz de detectar variaciones en las distintas muestras a analizar. Esto permitirá el análisis comparativo entre las distintas variedades de tomates buscando diferenciar frutos en cuanto a su sabor y aroma. Referencias 1. Goff S.A, Klee H.J., Science, 2006, 311, pp. 815-819. 2. Tikunov Y., et al, Plant Physiol. 2005, 139, 1125. 3. Bezman Y. et al, J. Agric. Food. Chem, 2003, 51, pp. 722-726.