Inmunodetección de PAX8 en cortes de criostato de la glándula tiroides de ratón

GATICA, LAURA VIRGINIA; NICOLA, JUAN PABLO; MAZZUDULLI, GINA; PEYRET, VICTORIA

Rosario Santa Fe

Congreso; XXIV Congreso Argentino de Histotecnología; 2019

Sociedad Argentina de Histtecnología

Introducción: La glándula tiroides es un importante órgano endocrino cuya función es la secreción de las hormonas T3 y T4. Durante el desarrollo embrionario comienza a expresarse el factor de transcripción PAX8, el cual regula la organogénesis y la diferenciación de la glándula. Las secciones congeladas obtenidas con criostato conservan de manera eficiente la estructura de las proteínas, siendo el método más idóneo para analizar la expresión de antígenos por inmunofluorescencia (IF). Objetivo: Optimizar la detección en tiroides de PAX8 por IF en cortes de criostato.Materiales y Métodos: Se seleccionaron dos grupos de ratones de la cepa C57BL/6 que se denominaron Grupos A y B, los cuales se sometieron a perfusión intracardíaca y posterior extracción de la glándula. Procedimientos en el Grupo A: se llevó a cabo la perfusión con solución de PFA en buffer PB (4%), post-fijación por inmersión de la tiroides overnight a temperatura ambiente (TA), lavados con PBS y conservación en solución de sacarosa (30%)-azida sódica (0,01%) en PBS a 4°C hasta su inclusión en OCT. Procedimientos en Grupo B: se llevó a cabo la perfusión con PBS, confección de los tacos en OCT y congelamiento en Nitrógeno líquido (NL), manteniéndolos a -80°C hasta su corte en criostato. En ambos grupos se obtuvieron cortes de 7 y 5 micras de espesor que fueron montados en portaobjetos con carga positiva (HDA). Los cortes obtenidos del Grupo B se fijaron con acetona fría (-20°C) por 20 min y se conservaron a -80°C hasta su uso. Para la IF, los cortes de ambos grupos fueron hidratados con buffer Tris (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH: 7,6). En el caso del Grupo A, los cortes se sometieron a recuperación antigénica inducida por calor con buffer citrato de sodio 1mM, pH: 6 o con buffer Tris-EDTA, pH: 9. Luego, los cortes de todos los grupos fueron bloqueados y permeabilizados en cámara húmeda por 1h a TA en buffer Tris adicionado con suero normal de la especie de origen del anticuerpo (Ac) secundario (10%) y Tritón X-100 (0,2%). El Ac primario anti-PAX8 (rabbit polyclonal antibody, Protein Tech cat#10336-1AP) se incubó overnight a 4°C en cámara húmeda (diluciones 1/50, 1/100, 1/200) en buffer TRIS con Albúmina Sérica Humana (HSA, 2%) y Tritón X-100 (0.2 %). El Ac secundario (Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG, ThermoFisher cat#A-11037) se incubo 1h a TA (dilución 1/500). El contraste nuclear se realizó con DAPI (1ug/ml) y el montaje de las tinciones con FluorSave. Las imágenes se obtuvieron con el microscopio invertido de epifluorescencia Leica DM18.Resultados: La marca del antígeno nuclear PAX8 se evidenció solo en los cortes de tiroides (dilución del Ac 1/200) obtenidos a partir de tejido congelado en NL (Grupo B) y con un grosor de 5 um.Conclusión: Las secciones congeladas constituyen la clásica preparación de los tejidos para IF, ya que la reactividad antigénica se encuentra menos deteriorada. Es conocido que la fijación con PFA ocasiona fenómenos de autofluorescencia y el bloqueo de una gran cantidad de determinantes antigénicos. La experiencia en nuestro laboratorio confirma que los cortes de criostato de tiroides congelada con NL es la mejor alternativa para la inmunodetección de PAX8, ya que la marca nuclear obtenida es de alta especificidad y sensibilidad.