VÍAS BIOQUÍMICAS INVOLUCRADAS EN LA HEPATOXICIDAD DE AFLATOXINA B1 Y FUMONISINA B1

VELEZ, PILAR ANDREA; RUBINSTEIN, HÉCTOR RAMÓN; GUASCONI, LORENA; THEUMER, MARTÍN GUSTAVO; MARY, VERÓNICA SOFÍA; OTAIZA, SANTIAGO NICOLAS

Puebla

Congreso; VIII SLAM CONGRESO; 2017

SOCIEDAD LATINOAMERICANA DE MICOTOXICOLOGIA

La exposición oral humana a aflatoxina B1 (AFB1) y fumonisina B1 (FB1) se asocia con un aumento del carcinoma hepatocelular (Li et al., 2001). Sin embargo, aunque la evidencia sugiere que la combinación de AFB1-FB1 produce hepatotoxicidad interactiva, los mecanismos subyacentes aun no han sido esclarecidos. La toxicología de AFB1 está íntimamente ligada a su biotransformación al metabolito genotóxico AFB1-exo-8,9-epóxido (AFBO), y en menor grado a la inducción de estrés oxidativo. El sitio predominante del metabolismo de esta micotoxina es el hígado a través de la actividad del citocromo P450 (CYP), principalmente 1A2 y 3A4 en humanos. Además, la actividad de CYP genera especies reactivas de oxígeno (ROS), debido a la fuga de electrones que se produce durante el tránsito de los mismos por una cadena de transporte electrónico. Otras enzimas metabolizadoras de AFB1 son las lipoxigenasas (LOX) y la prostaglandina H sintasa (PHS), las cuales son componentes principales de la cascada metabólica del ácido araquidónico (AcAr), cuyo paso limitante es la liberación del AcAr de las membranas por fosfolipasa A2 (PLA2). Las ROS también se generan como subproductos durante el metabolismo oxidativo de AcAr por PHS y LOX, así como a través de la inducción de la actividad de NADPH oxidasas por AcAr.A diferencia de AFB1, FB1 no es metabolizada, y su mecanismo de toxicidad más reconocido es la disrupción del metabolismo de esfingolípidos a través de la inhibición de la enzima ceramida sintasa, lo que conduce a una alteración de la funcionalidad de las membranas celulares. La hipótesis de este trabajo es que AFB1 y FB1 producen efectos hepatotóxicos interactivos causados por el aumento de AFBO y la inducción estrés oxidativo, mediante la activación de vías bioquímicas metabolizadoras de AFB1 y generadoras de ROS.Objetivos experimentales: Los objetivos de este trabajo fueron evaluar la posible interacción tóxica de AFB1 y FB1 en células hepáticas, así como también, elucidar la contribución del estrés oxidativo en la toxicidad combinada, y la participación de vías bioquímicas metabolizadoras de AFB1, como CYP1A y el metabolismo del ácido aráquidónico.Diseño experimental:Cultivo celular: La línea celular de hígado de rata Buffalo BRL-3A, obtenida de la ATCC, fue cultivada en medio DMEM suplementado con 10 % de SFB, 1 % de L-glutamina y 50 g de gentamicina, y tratada con 20 μM de AFB1 disuelta en DMSO (concentración final: 8 mM), 30 μM de FB1 disuelta en PBS, o con una mezcla de AFB1-FB1 (20 μM AFB1, 30 μM FB1, MIX) durante 24 h, a 37 °C, en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Para evaluar la participación del estrés oxidativo en los efectos hepatotóxicos de las micotoxinas individuales y combinadas, las células fueron pre-incubadas en presencia o ausencia de N-acetil-L-cisteina (NAC, 5 mM) por 0.5 h antes y durante los tratamientos con las micotoxinas.Análisis de la expresión de p53: Fue evaluada mediante Western blot. Los extractos de proteínas de las células fueron separados en un gel de poliacrilamida con SDS al 10 %, y luego transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente, la membrana fue bloqueada con 5 % de leche descremada en solución tampón Tris-HCl conteniendo 0,01% de Tween 20, pH 8,3 (TBS-T), durante 1 h, e incubada con los anticuerpos anti-p53 y anti-β-actina (utilizado como control de carga) diluidos en 5 % de leche descremada en TBS - T a 48 ºC durante una noche. Después de tres lavados con TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano en TBS-T durante 1,5 h a temperatura ambiente. Las bandas se revelaron mediante una reacción de quimioluminiscencia con placas radiográficas, y fueron cuantificadas mediante un análisis densitométrico usando el software (Gel-Pro Analyzer version 3.1).Evaluación del potencial de membrana mitocondrial (PMM): Los cambios en el PMM fueron evaluados mediante tinción con la sonda fluorescente TMRE (50 nM) durante 0.5 h a 37 °C, y analizados por citometría de flujo (Scaduto et al., 1999). Se adquirieron 20000 eventos por cada muestra (λ de excitación 488 nm; λ de emisión 574 nm). Medición de la actividad de fosfolipasa (PLA): La actividad de PLA fue determinada usando un fosfolípido fluorogénico sintético bis-BODIPY FL C11-PC, que al ser clivado por dicha enzima emite fluorescencia verde (Meshulam et al., 1992). La sonda fue combinada con fosfatidilserina para obtener liposomas unilamelares pequeños que fueron incorporados a la cara interna de la membrana plasmática de las células BRL-3A. Luego, las células fueron lavadas con PBS y resuspendidas en PBS conteniendo 1.5 mM Ca2+/1.5 mM Mg2+, pH 7.3, durante 10 min a 37 °C. La reacción fue parada con el agregado de una solución fría que contenía 2 mM de EGTA, 150 mM de NaCl, y 1% de BSA libre de ácidos grasos. Las células fueron analizadas por citometría de flujo, adquiriendo 20000 eventos por cada muestra (λ de excitación 488 nm; λ de emisión 530 nm). Medición de la actividad de CYP1A: El ensayo EROD (7-ethoxyresorufin-O-deethylase) fue usado para estimar la actividad de CYP1A (Mary et al., 2015). Las células se lavaron con PBS y congelaron en nitrógeno líquido. Luego, se añadió a cada muestra una mezcla de reacción que contenía tampón Na2HPO4 (50 mM, pH 8,0), 7-etoxiorresorufina (1,25 μM), dicumarol (20 μM) y NaDPH (0,5 mM). La formación del producto resorufina se midió a λ 532 y 590 nm de excitación y emisión, respectivamente, en un lector de microplacas, durante 1 min. Las concentraciones de resorufina se determinaron a partir de una curva de calibración con el estándar de resorufina (0-50 pmol), y luego se normalizaron por mg de proteína a partir de una curva patrón de BSA mediante el método de Bradford. La actividad de EROD se expresó como pmol resorufina/mg de proteína/min.Análisis estadísticos: Los datos fueron obtenidos de tres experimentos independientes (n=6, para cada experimento), y estudiados mediante el análisis de la varianza (ANOVA) de una vía y test de comparaciones múltiples de Bonferroni usando un software Graph-PadInStat version 3.01. Los resultados fueron expresados como la media ± el error estandar de la media (SEM), y las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas cuando p