Genotoxicidad de extractos de teliosporas de Thecaphora frezii en células intestinales humanas Caco-2: Ensayo de micronúcleos.

ARIAS, SL; RUBINSTEIN, HR; MARY, VS; VELEZ, PA; OTAIZA GONZÁLEZ, SN; THEUMER, MG

General Cabrera. Córdoba.

Jornada; XXXI Jornada nacional del maní.; 2016

CIA General Cabrera

IntroducciónDurante la campaña agrícola 1994/95 se detectaron por primera vez en Argentina, frutos de maní con carbón, provenientes de la región centro-norte del área manisera de Córdoba. Posteriormente se evidenció que la patología era producida por el hongo Thecaphora frezii. La ingesta de maní con carbón, o de sus productos derivados, podría causar toxicidad en la población que los consume; aunque en la actualidad disponemos de información toxicológica muy escasa que avale o descarte de plano esta aseveración.Mediante ensayos de genotoxicidad realizados por nuestro grupo, evaluamos la fragmentación del ADN por el ensayo del cometa en células mononucleares de bazo (CMB) obtenidas de ratas Wistar que fueron alimentadas durante 180 días con maní infectado por T. frezii. Los resultados mostraron indicios de una posible acción genotóxica producida por algún constituyente de las teliosporas sobre las CMB. Por otra parte, mediante el Test de Ames observamos que extractos de teliosporas realizados con metanol, acetato de etilo y hexano, no produjeron efectos mutagénicos en cultivos de Salmonella typhimurium, y este resultado no fue modificado por la presencia de un sistema metabólico extracelular, el cual podría conferir genotoxicidad a los extractos. En este contexto, es necesario aumentar las evidencias experimentales que permitan asignar o descartar actividad genotóxica a componentes de las teliosporas de T. frezii. ObjetivoEvaluar la genotoxicidad de extractos de teliossporas de T. frezii en la línea celular Caco-2, de epitelio de colon humano. Materiales y MétodosSe prepararon tres extractos de teliosporas con hexano (E-Hex), acetato de etilo (E-AcEt), y metanol (E-MeOH), a los fines de separar los compuestos liposolubles, de polaridad intermedia, y los compuestos más polares, respectivamente. Para esto se utilizaron teliosporas purificadas a partir de maní contaminado, cosechado en la campaña 2013-2014. Los extractos fueron evaporados a sequedad bajo corriente de nitrógeno, luego resuspendidos en dimetilsulfóxido (DMSO) a razón de 1 mL de DMSO por 1 gramo de teliosporas. Los extractos redisueltos en DMSO fueron esterilizados por filtración y conservados a 4 °C hasta su uso. Las células intestinales Caco-2 (50.000 células/placa de 35 mm de diámetro) fueron cultivadas por 24 horas con medio de cultivo DMEM (suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 2 mM de glutamina y 50 μg/mL de gentamicina), a 37 °C y 5 % de CO2. Luego, el medio de cultivo se reemplazó por DMEM (Control basal), y DMEM con 1% E-Hex / E-AcEt / E-MeOH / DMSO (Control de vehículo), y las células se incubaron otras 24 horas en las mismas condiciones. Finalizada la exposición a los extractos de teliosporas, las células se cultivaron por 24 horas con DMEM conteniendo citocalasina B (3 μg/mL), se fijaron con una solución de paraformaldehído, y se tiñeron con el colorante Hoescht (1 μg/mL en buffer salino). Se realizó la observación por microscopía de fluorescencia, y se tomaron fotos mediante una cámara acoplada al microscopio. Se contaron 500 células binucleadas en cada tratamiento, y se determinó el porcentaje de células binucleadas con micronúcleos.Resultados y discusiónEstudios previos mostraron que los extractos no indujeron citotoxicidad mayor al 20 % en las células Caco-2 cuando fueron utilizados en concentraciones hasta 1 % en el medio de cultivo DMEM, por lo cual se utilizó esta concentración para evaluar la actividad genotóxica.Los tratamientos con E-Hex, E-AcEt y E-MeOH indujeron 7 % de micronúcleos en todos los casos, mientras que en células Caco-2 cultivadas con DMEM y DMSO se observaron 8 y 7 % de micronúcleos, respectivamente.ConclusionesLos resultados de estos experimentos refuerzan la idea de que las teliosporas, o sus componentes, no tienen actividad genotóxica en células humanas. Financiación: El presente trabajo fue financiado por Fundación Maní Argentino, PICT 2013-0750, PICT 2015-2810 y SECyT-UNC. Mary V.S. y Arias S.L. son becarias de SECyT-UNC. Otaiza S.N. es becario de CONICET. Velez P.A. es becaria de FONCyT. Theumer M.G. es investigador de CONICET.