Regulación de la vía de señalización del factor de transcripción NF-κB en respuesta a la activación del receptor de la hormona estimulante de tiroides.

NAZAR, M; PEYRET, V; NICOLA, JP; MARTIN, M; MASINI-REPISO, AM; REALE, C; VITO, P

Santiago del Estero

Congreso; XI Congreso de la Federación Argentina de Sociedades de Endocrinología; 2016

Federación Argentina de Sociedades de Endocrinología

Introducción y Objetivos: Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) constituyenuna familia de receptores que desempeñan funciones importantes en ladiferenciación, proliferación y supervivencia celular. Particularmente, la estimulación del receptor de TSH modula la diferenciacióny función de la célula folicular tiroidea. Los GPCRs gatillan diferentes víasde señalización intracelular desencadenando la activación de diversos factoresde transcripción, incluyendo NF-κB. Existeevidencia que avala la activación de NF-κB en células foliculares tiroideas por TSH oanticuerpos estimulantes del receptor de TSH, aunque los mecanismos queresultan en la activación de NF-κB no han sido explorados. Resultados previos denuestro laboratorio demostraron la participación de NF-κB en la regulación degenes involucrados en la síntesis de hormonas tiroideas en respuesta a la endotoxinabacteriana lipopolasacárido (1). Adicionalmente, reportamos la presencia demecanismos autoregulatorios mediados por S-nitrosilación que operarían luego dela activación del receptor de TSH para regular la actividad transcripcional deNF-κB (2). Recientemente, Reale et al.(3) demostraron que ratones deficientes en NEMO, proteína miembro del complejoIκB quinasa (IKK) clave en la activación canónica de NF-κB, desarrollan un estado de hipotiroidismo producto de una dramáticapérdida de células foliculares tiroideas en respuesta a la activación demecanismos apoptóticos.El objetivo del trabajo comprendió el estudio de losmecanismos que median la activación de NF-κB en respuesta a la activación del receptor de TSH ysu función como mediador transcripcional de la expresión de genes involucradosen la síntesis de hormonas tiroideas. Material yMétodos: Como modelo se utilizó la línea celular derivada de tiroides FRTL-5 y cultivos primarios de células folicularestiroideas aisladas de ratones transgénicos deficientes en la proteína NEMO (3).La expresión de proteínas y ARN mensajero se evaluó por Western blot y PCR entiempo real. La actividad transcripcional de promotores y la unión de factoresde transcripción a un promotor determinado se evaluó mediante ensayos de genreportero e inmunoprecipitación de la cromatina. El silenciamiento de laexpresión de genes se realizó mediante ARN de interferencia. El análisisestadístico se realizó mediante test ANOVA conjuntamente con el test decomparación múltiple Newman-Keuls considerandosignificativo p<0.05. Resultados: El tratamientocon TSH indujo la actividad transcripcional de NF-κB en célulasFRTL-5 transfectadas con un vector artificial de respuesta a NF-κB. Utilizandoel mismo esquema experimental, se evaluó la participación de quinasasinvolucradas en la señalización gatillada por la activación del receptor deTSH. La inhibiciónfarmacológica de PKA (H89) y PKC (Chelerythrine) bloqueó la activación de NF-κB inducida por TSH. Complementariamente, observamos que el tratamiento con TSH indujo elreclutamiento nuclear de la subunidad p65 de NF-κB. Sin embargo, sólo la inhibición farmacológica dePKC bloqueó la acumulación nuclear de p65. Determinamos laparticipación de la vía canónica de activación de NF-κB mediante la fosforilaciónde las quinasas IKK-α e IKK-β (Ser-176/180) en respuesta a TSH. Adicionalmente,el tratamiento con TSH indujo la fosforilación de IκB-α (Ser-32) y su posteriordegradación proteasomal, dando lugar a la translocación de p65 hacia el núcleode células FRTL-5. En coincidencia, el inhibidor farmacológico de la actividadquinasa de IKK-β (BAY 11-7082) que inhibe la fosforilación de IκB-α bloqueó laactivación transcripcional de NF-κB en respuesta a TSH.Posteriormente evaluamosla participación de la quinasa TAK-1 en la activación de NF-κB inducidapor la actividad de PKC que ocurriría luego de la activación del receptor deTSH. Observamos que el  tratamiento conTSH indujo la fosforilación de TAK-1 (Thr-184/187), y el silenciamiento deTAK-1 inhibió la fosforilación de IKK-α e IKK-β y la activaciónde NF-κB en respuesta al estímulo de TSH. Por otra parte, establecimos un vínculoentre la fosforilación de p65 (Ser-276) dependiente de la actividad quinasa dePKA y la inducción de la actividad transcripcional de NF-κB en respuesta a TSH.Además, observamos que TSH estimula la actividad transcripcional de NF-κB mediante laacetilación de p65 (Lys-310) en respuesta al reclutamiento de las acetil-transferasasCBP/p300.La evaluación del rol de NF-κB como mediador delefecto fisiológico de TSH sobre la expresión de diferentes genes involucradosen la síntesis de hormonas tiroideas demostró que la presencia de BAY 11-7082redujo significativamente la expresión génica en respuesta al estímulo de TSH. Coincidentemente,células foliculares tiroideas aisladas de ratones deficientes en la proteínaNEMO mostraron una expresión disminuida de diferentes genes involucrados en la síntesishormonal cuando fueron estimulados con TSH en comparación con células aisladasde ratones control. La deficiencia funcional de NF-κB no afectó laexpresión y/o función del receptor de TSH. Adicionalmente, BAY 11-7082 disminuyóel efecto de TSH sobre la estimulación de la región promotora de genesinvolucrados en la síntesis hormonal indicando su participación a niveltranscripcional. En estrecha relación, el análisis bioinformático reveló lapresencia de sitios consenso para NF-κB en sus regiones promotoras, y ensayos deinmunoprecipitación de la cromatina confirmaron que el estímulo con TSH inducela unión de la subunidad p65 a las regiones promotoras. Complementariamente, laremoción de las regiones consenso NF-κB identificadas mediante mutagénesis sitio-dirigida demostró su funcionalidaden respuesta a la estimulación con TSH y el silenciamiento de la expresión dep65 permitió corroborar su participación en la estimulación de TSH sobre laexpresión génica.  Conclusiones: La activacióndel receptor de TSH conduce a la inducción del complejo regulador IKK, endependencia de la actividad de PKC, activando la vía canónica de señalizacióndel factor de transcripción NF-κB. Aunque el mecanismo por el cual el complejoIKK es activado en respuesta a la estimulación de GPCRs es poco conocido, observamosque la quinasa TAK-1 es activada por TSH y participa en la fosforilación delcomplejo IKK y posterior activación de NF-κB.Lafosforilación de NF-κB desempeña un rol importante en la regulación de suactividad transcripcional. Particularmente, observamos que TSH induce laactividad transcripcional de NF-κB mediante la fosforilación de p65 en Ser-276en dependencia de la actividad de PKA. Adicionalmente, la modificación en laactividad transcripcional de p65 producto de la fosforilación en Ser-276 seasocia con el reclutamiento de las acetil-transferasas CBP/p300 y la acetilaciónde p65 en Lys-310.La evaluacióndel rol desempeñado por NF-κB en la fisiología tiroidea demostró laparticipación de la subunidad p65 como efector transcripcional de laestimulación inducida por TSH sobre la expresión de genes involucrados en la síntesishormonal. Nuestros resultados señalan a NF-κB como un mediador relevante en laexpresión genética y diferenciación de la célula folicular tiroidea.Crecienteevidencia indica que NF-κB participa en la patogenia de diversas enfermedadesautoinmunes, siendo un factor clave en la vinculación de procesos inflamatoriosasociados al desarrollo de cáncer en modelos experimentales. Puede especularseque una alteración en la señalización mediada por TSH estaría implicada en lacarcinogénesis de procesos neoplásicos que afectan la glándula tiroides, asícomo en la patogénesis de enfermedades autoinmunes a través de la modulación dela señalización de NF-κB. Referencias: 1.   Nicola J.P. et al. (2010)Mol Endocrinol. 24(9):1846-622.   Nicola J.P. et al. (2015)Endocrinology. 156(12):4741-543.   Reale C. et al. (2016) J Biol Chem. 291(11):5765-73.