Identificación de una mutación en la región carboxilo terminal del transportador de sodio/ioduro en un paciente con hipotiroidismo congénito

SIGNORINO, M; MUÑOZ, L; MARTIN, M; SOBRERO, G; MASINI-REPISO, AM; NICOLA, JP; TESTA, G; MIRAS, M

Santiago del Estero

Congreso; XI Congreso de la Federación Argentina de Sociedades de Endocrinología; 2016

Federación Argentina de Sociedades de Endocrinología

Introducción y Objetivos: El defecto en el transporte deyoduro (ITD) es un trastorno autosómico recesivo causado por la incapacidad dela célula folicular tiroidea de acumular yoduro, conduciendo al desarrollo de hipotiroidismocongénito dishormonogénico (1).Los criterios diagnósticos incluyen glándula tiroides eutópica con gradovariable de bocio, captación de yoduro reducida, relación saliva-plasma deyoduro reducida y tiroglobulina plasmática normal o aumentada (1). Sin embargo, elespectro clínico de los fenotipos resultantes varía desde cuadros eutiroideoshasta hipotiroidismos severos.La acumulación deyoduro constituye el primer paso en la síntesis de hormonas tiroideas, siendoel transportador de sodio/yoduro (NIS) quién cataliza el transporte activo deyoduro.Defectos genéticos que conducen a la pérdida de función de NIS han sidoidentificados en pacientes con ITD. La caracterización molecular de diferentes mutantes de NIS hapermitido obtener información sobre los procesos que median la especificidad desustratos, la estequiometria del transporte y el tráfico de la proteína a lamembrana plasmática. El objetivo deltrabajo ha sido el estudio de la presencia de mutaciones en el gen que codificaNIS en un paciente pediátrico con hipotiroidismo congénito sospechado de ITDsobre la base de captación de 99mTc-pertecnectato severamentereducida y presencia de glándula tiroides eutópica. Descripción delcaso clínico: Mediante pesquisa neonatal se observó un nivel anormalmente alto de TSH(64 µIU/ml). El análisis bioquímico de la función tiroidea mostró TSH 203µIU/ml, T4 libre 1,6 ng/dl, T4 total 8,7 µg/dl, T3121 ng/dl y tiroglobulina 84 ng/ml. La centellografía tiroidea de 99mTc-pertecnectatomostró una acumulación severamente reducida. La ecografía tiroidea mostró unaglándula de tamaño normal. No se evidenció la presencia de anticuerposanti-tiroideos. Se inició terapia de reemplazo con una dosis diaria de 14 μg/kg levotiroxina a los 10 días devida. Materiales y métodos: El ADN genómico fue extraído decélulas mononucleares de sangre periférica y los 15 exones del gen que codificaNIS fueron examinadas mediante el secuenciamiento de fragmentos amplificadospor PCR. El estudio genético fue aprobado por el comité de ética del Hospitalde Niños de la Santísima Trinidad de Córdoba y realiza bajo consentimientoinformado por escrito en conformidad con normas y protocolos éticos vigentes.Como modelo de estudioin vitro se utilizaron células nopolarizadas Cos-7 que no expresan NIS endógenamente transfectadas de formatransiente con diversos plásmidos que expresan NIS en su versión salvaje omutado mediante la estrategia de mutagénesis sitio-dirigida. La función de NISse evaluó mediante de ensayos de captación de 125I--yoduroy su expresión o localización se evaluó mediante citometría de flujo einmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos.Resultados: El análisis reveló la presencia deuna transición homocigota G>A en el nucleótido 1.682 (exón 14) que resultaen la sustitución de la glicina en la posición 561 por un ácido glutámico(G561E). Posteriormentese realizaron estudios in vitro conel fin de comprender las bases moleculares que conducen a la pérdida de laacumulación de yoduro en presencia de la mutación identificada. Células Cos-7 fuerontransfectadas de forma transiente con plásmidos que expresan el ADNcomplementario de NIS humano (WT NIS) o la mutante G561E NIS.Sorprendentemente, células transfectadas con G561E NIS acumularon nivelessimilares de 125I--yoduro a aquellas transfectadas con WTNIS. Elanálisis mediante citometría de flujo demostró que el porcentaje de célulastransfectadas y los niveles de expresión de G561E NIS en la membrana plasmáticay totales fueron similares a aquellos de WT NIS.Considerando la presencia de la mutación en la región carboxilo terminalevaluamos la importancia de dicha región en el tráfico del transportador a lamembrana plasmática. La deleción de la región carboxilo terminal de NIS(residuos 546 a 618) impide la localización de la proteína truncada (Δ546 NIS) enla membrana plasmática de células Cos-7 y por consiguiente conduce a un defectoen la acumulación de 125I?yoduro. Estosresultados indicarían que la región carboxilo terminal, de localizaciónintracelular, actuaría directamente como determinante en el anclaje deproteínas que direccionen el tráfico de NIS hacia la membrana plasmática.Conclusiones: En elpresente trabajo, hemos identificado una nueva mutación (G561E) en el gen quecodifica NIS en un paciente pediátrico con hipotiroidismo congénito sospechadode ITD sobre la base de captación de 99mTc-pertecnectato severamentereducida y presencia de glándula tiroides eutópica. La mutación G561Econstituye la primera mutación identificada en la región carboxilo terminallocalizada en la región intracelular de la proteína. El estudio revela la importancia de la región carboxilo terminal de NISen el tráfico de la proteína a la membrana plasmática. El análisis de dichasecuencia revela la presencia de diversos motivos conservados involucrados enel direccionamiento de proteínas hacia la membrana plasmática. Particularmente,los últimos cuatro aminoácidos de la región carboxilo terminal de NIS componenun dominio putativo PDZ clase I potencialmente involucrado en eldireccionamiento hacia la membrana basolateral. En adición, se observa lapresencia de un potencial motivo di-leucina (L562L563)que podrían interaccionar con el complejo adaptador de clatrina AP-1involucrado en el tráfico basolateral de proteínas.La caracterizaciónfuncional de las mutantes de NIS identificadas en pacientes con ITD R124H, V270Ey G543E demostró que el cambio de un único amino ácido causa la retenciónintracelular de NIS en células no polarizadas Cos-7. Aunque el mecanismo por el cual lamutación G561E impide la actividad de NIS permanece desconocido, hipotetizamos quela carga negativa del residuo G561 interferiría el reconocimiento del motivo dileucinaL562L563 adyacente por proteínas adaptadoras quedireccionan el tráfico intracelular de la proteína, afectando su llegada a lamembrana plasmática basolateral en células epiteliales polarizadas. Estudios encurso evaluando la localización de G561E NIS en células polarizadas proveeráevidencia sobre los mecanismos que operan en la regulación de la llegada de NISa la membrana plasmática.