EL SISTEMA ALFA-2 MACROGLOBULINA / LRP1 REGULA LA ACTIVIDAD DE MT1-MMP EN CELULAS GLIALES DE MULLER

BARCELONA P; JALDIN-FINCATI J; CHIABRANDO GA; SANCHEZ MC

Congreso; VIII Congreso Nacional de la Asociaci¨®n en Investigaci¨®n en Visi¨®n y Oftalmolog¨ªa (AIVO); 2011

Objetivos: Las metaloproteinasas (MMPs) son mol¨¦culas claves durante la neovascularizaci¨®n ya que participan activamente en la degradaci¨®n de la matriz extracelular. Resultados previos de nuestro grupo demuestran que c¨¦lulas gliales de M¨¹ller bajo tratamiento con ¦Á2Macroglobulina (¦Á2M), inducen a trav¨¦s de su receptor (LRP1) la regulaci¨®n de la actividad de MMPs, principalmente MMP-2. Con el prop¨®sito de profundizar estos hallazgos nos planteamos la evaluar posibilidad de que el sistema ¦Á2M/LRP1 regule la funci¨®n de MT1-MMP, principal metaloproteinasa de membrana encargada de activar MMP-2. Por lo tanto nuestro objetivo fue estudiar los aspectos moleculares y celulares que regulan la actividad de MT1-MMP, bajo est¨ªmulo con ¦Á2M, en c¨¦lulas gliales de M¨¹ller. Materiales y m¨¦todos. Se emple¨® una l¨ªnea inmortalizada de c¨¦lulas gliales retinales, MIO-M1 que expresan constitutivamente el receptor LRP1. A trav¨¦s de ensayos de inmunoprecipitaci¨®n se evalu¨® la formaci¨®n de un complejo molecular MT1-MMP/LRP1. Para ello, c¨¦lulas MIO-M1 tratadas con ¦Á2M 60 nM durante 4 h, fueron lisadas e incubadas con perlas magn¨¦ticas conteniendo anticuerpos anti-subunidad ¦Á de LRP1 o anti-MT1-MMP. Los respectivos inmunoprecipitados se revelaron por Western blot empleando anticuerpos anti-cadena ¦Â de LRP1 (Calbiochem) o anti MT1-MMP respectivamente. Para evaluar la distribuci¨®n y localizaci¨®n subcelular de MT1, as¨ª como su interacci¨®n con LRP1, c¨¦lulas MIO-M1 fueron transfectadas con un vector de expresi¨®n MT1 MMP fusionada a GFP (MT1-MMP-GFP). Transcurridas 48 h post transfecci¨®n, los cultivos fueron incubados con ¦Á2M 60 nM a 37 ¡ãC durante 5, 10, 15 y 30 min. Luego, las c¨¦lulas fueron lavadas con PBS, fijadas, permeabilizadas e incubaron con anticuerpo monoclonal anti-cadena ¦Â de LRP1 o anticuerpo policlonal anti-EEA1 (Abcam ab2900) y reveladas con anticuerpos secundarios, conjugados con Alexa-Fl¨²or594 (Molecular Probes). Finalmente se visualiz¨® mediante microscop¨ªa confocal (Olympus FV-300). Resultados. Los ensayos de inmunoprecipitacion mostraron una asociaci¨®n entre LRP1 y MT1-MMP, tanto en c¨¦lulas estimuladas con o sin ¦Á2M, a juzgar por los ensayos de Western blot para cada una de las prote¨ªnas analizadas. No obstante a partir de los an¨¢lisis cuantitativos efectuados por densitometr¨ªa se dedujo un incremento en la asociaci¨®n entre MT1-MMP y LRP1 en c¨¦lulas tratadas con ¦Á2M. Adem¨¢s, en c¨¦lulas transfectadas y estimuladas con ¦Á2M se evidenci¨® por microscop¨ªa confocal una marcada colocalizaci¨®n de MT1-MMP con LRP1 en ves¨ªculas EEA1 positivas coincidiendo con lo observado en la inmunoprecipitaci¨®n. Conclusi¨®n. Considerando que a2M/LRP1 indujo una incrementada interacci¨®n molecular entre LRP1 y MT1-MMP, la cual tendr¨ªa lugar en endosomas tempranos. Demostramos que el sistema a2M/LRP1 promueve una activacion diferencial de MT1 MMP en la membrana celular de CM.