PCR fingerprinting para identificación y epidemiología de dermatofitos

SPESSO FLORENCIA; TANIA NUNCIRA; DIANA T. MASIH.; IACOBELLI LUCIANA; DIB MOISES; CHIAPELLO LAURA

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología: XXII Jornadas Argetinas de Micología.; 2011

Asociacion Argentina de Micologia

La PCR fingerprinting es un método que permite establecer patrones de ADN en animales, plantas y otros organismos con el fin de identificar individuos de diversas especies y estudiar diversidad genética. En las infecciones por dermatofitos no siempre se logra identificar en género y especie al agente causal por los métodos micológicos de rutina. Por otra parte, existen muy pocos reportes sobre la variabilidad genética de los dermatofitos y la aplicación de métodos moleculares en estudios epidemiológicos. Los objetivos de este trabajo fueron: (1) Desarrollar y estandarizar técnicas de PCR fingerprinting utilizando los primers (GACA)4, (GTG)5 y/o M13 para identificar especies de dermatofitos. (2) Aplicar PCR fingerprinting con los primers OPI-07 y OPK-20 en estudios epidemiológicos moleculares de las infecciones por Microsporum canis en el Hospital Pediátrico del Niño Jesús de la Ciudad de Córdoba. Para ello se recolectaron muestras de pacientes con sospecha clínica de dermatofitosis concurrentes al Servicio de Dermatología del Hospital Pediátrico del Niño Jesús de Córdoba Capital. Las muestras fueron procesadas para examen directo y los hongos aislados y tipificados luego de crecimiento en Sabouraud y Agar-papa. Se utilizaron además cepas de referencia del Instituto Pasteur de Francia. Se obtuvo el ADN genómico a partir de colonias puras por pulverización en mortero con aire líquido, seguido por la extracción con fenol-cloroformo. Las amplificaciones se realizaron utilizando los primers:(GACA)4, (GTG)5, M13, OPI-07 y OPK-20. Se realizaron 39 ciclos: 1 min. de desnaturalización a 93 ºC, 1 min de annealing a 45 ºC y 1 min de extensión a 72 ºC . La visualización de los productos se realizó luego de su corrida en geles de agarosa al 2% con SybreSafe (Invitrogen). Los análisis de imágenes y de los datos epidemiológicos se realizaron con los programas GEL-PRO ANALIZER 3.1.00.00. y EPI info 2000, respectivamente. Resultados: La PCR con (GACA)4 y M13 mostró perfiles definidos para Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum y T. interdigitale. Con (GACA)4 se observaron los patrones más simples y reproducibles. Con (GTG)5 se obtuvieron patrones característicos para cada una de las especies fúngicas, permitiendo identificar además T. mentagrophytes y T. tonsurans. Sin embargo, la PCR con este primer mostró patrones complejos y menos reproducibles que con (GACA)4. El estudio de variabilidad genética de 37 cepas de M. canis por PCR con OPK-20 demostró la presencia de 5 patrones, pero no se encontró correlación entre algún patrón genético y el sitio de la lesiones, características clínicas de las mismas o con la región geográfica de los aislamientos. Sin embargo, la PCR con OPI-07 distinguió dos cepas de M. canis, una de las cuales mostró  restricción geográfica en el sector noroeste de la ciudad de Córdoba.  Conclusiones: La PCR fingerprinting con (GACA)4 es un método rápido, sencillo y reproducible para identificar M. canis, M. gypseum, T. rubrum y T. interdigitale. Para identificar T. mentagrophytes y T. tonsurans se debería realizar PCR con (GTG)5. Por otra parte, este trabajo propone la PCR fingerprinting con OPI-07 u OPK-20 como un método reproducible para investigar variabilidad genética de cepas de dermatofitos y su aplicación en estudios epidemiológicos.