OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO BIOUTOGRÁFICO PARA LA DETECCIÓN DE INHIBIDORES DE Mycobacterium smegmatis

GAGO, G.; GRAMAJO, H.; RAMALLO, IA; FURLÁN, R

Rosario

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2019

Sociedad de Biología de Rosario

La tuberculosis (TB) es la enfermedad infecciosa de mayor causa de mortandad a nivel mundial cuyo agente causal en humanos es Mycobacterium tuberculosis. La continua aparición de cepas multiresistentes y la re-emergencia de TB demandan el descubrimiento de nuevas drogas que puedan lidiar con esta situación y a la vez, reducir la duración y complejidad de las terapias actuales. Los extractos naturales representan una de las fuentes más importantes de nuevos quimiotipos con potencial terapéutico. Lamentablemente, como éstos son mezclas complejas, el hecho de encontrar un extracto con la actividad deseada representa solamente el comienzo de un largo y costoso proceso de fraccionamiento. Esto hace necesario el desarrollo de bioensayos sencillos que permitan adjudicar la actividad observada en una mezcla a los componentes responsables de la misma antes de ser separados. Este trabajo tiene como objetivo la optimización de un método bioautográfico que combina la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada (CCD) con un ensayo microbiológico que emplea Mycobacterium smegmatis. M. smegmatis es empleado como modelo (dada su no patogenicidad) en los primeros pasos de búsqueda de inhibidores para M. tuberculosis. Para el desarrollo de la metodología se utilizaron placas de CCD Silica Gel GF254 de 30.25 cm2 sembradas en el centro con 10 ug de isoniacida (inhibidor de referencia). Se analizaron 5 variables: concentración de LB-agar (1 o 2%p/v), volumen final de LB-agar a distribuir sobre la placa (0.13 o 0.20 mL/cm2), presencia/ausencia de tiloxapol (0.031 %v/v), cantidad de cultivo de M. Semegmatis (DO=0.6) (2.49-6.28 µL/cm2) y tiempo de incubación (24 o 48 hs). La combinación de todos los factores bajo estudio generó 18 ensayos que al término se revelaron con MTT para evidenciar las zonas de crecimiento, y se fotografiaron a los 30 min. Con el objetivo de optimizar la sensibilidad y calidad del ensayo, las imágenes se trabajaron en escala de grises definiéndose 3 respuestas experimentales: A) sensibilidad medida a través del diámetro del halo generado; B) contraste halo-matriz medido a través de la diferencia entre valores de pixeles de la matriz vs centro del halo; C) homogeneidad de la matriz medida como el desvío estándar de puntos de una línea trazada sobre la matriz. Se empleó GelPro 3.0 para la medición de las respuestas experimentales. Los resultados muestran que: 1) no se observó crecimiento a 2%p/v de agar y sí a 1%p/v; 2) la presencia de tiloxapol generó matrices con colonias distribuidas más homogéneamente; 3) un mayor tiempo de incubación y una mayor cantidad de inoculo inicial generó mayor contraste de color entre el halo y la matriz; 4) a menor volumen final distribuido sobre la placa mayor fue el tamaño del halo haciendo más sensible el ensayo. Por estas razones, se decidió trabajar con 0.13 mL/cm2 de 1%p/v de LB-agar conteniendo 6.28 µL/cm2 de cultivo (DO=0.6), y 0.031 %v/v mL de tiloxapol. El volumen final se distribuyó sobre CCDs de aceites esenciales de conocida actividad antimicobacteriana y se incubaron 48 hs. Al término, se rociaron con MTT visualizando claramente halos de inhibición. Para determinar el límite de detección se sembraron cantidades decrecientes de isoniacida en punto sobre una placa de CCD por triplicado. La presencia del inhibidor se visualizó hasta cantidades