CONTROLES PARA DETECCIÓN DE VIRUS A ARN

PEREZ, G. R.; VILLANOVA, G. VANINA; TABORDA, MIGUEL A.; GARDIOL, DANIELA; GIRI ADRIANA A

Buenos Aires

Otro; 5° Edición de la exposición de productos innovadores del Concurso INNOVAR; 2009

Secretaría de Planeamiento y Políticas en Ciencia e Innovación del Ministerio de Ciencia e Innovación del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva.

Trabajo seleccionado en el Concurso Innovar 2009La aplicación de la transcripción reversa (RT) seguida de la Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR) para el análisis de virus con genoma de ARN, tales como el Virus de la Hepatitis C (VHC) y elvirus de inmunodeficiencia humana (VIH), es un componente esencial del diagnóstico virológico. Elproblema más frecuente asociado a la técnica de RT-PCR es la falta de un control adecuado (ControlInterno: CI) que permita verificar en forma simultánea la eficacia de la extracción de ARN de lamuestra, la reacción de amplificación y la detección. Los únicos CIs disponibles que cumplen todos losrequerimientos para ensayos moleculares (estables, resistentes a ARNasas, seguros para ellaboratorista) han sido construidos con la tecnología armored, sujeta a protección por patentamiento.En el Area Virología de la FCByF hemosdesarrollado una estrategia para la construcciónde CI competitivos (CIC) derivados del colifagoQβ. Los CICs son ARN empaquetados encápsides fágicas, resistentes a la degradaciónpor ARNasas, inocuos y estables a 4°C. Pormedio de la misma, diseñamos un CIC para eldiagnóstico del virus de hepatitis C (VHC) porRT-PCR (CICVHC). El CICVHC es un fago Qβrecombinante en el que se reemplazaronsecuencias fágicas por cebadores usados en ladetección molecular de VHC, es estable a 4ºC yfue incorporado en el ensayo CICVHC RT-PCRdesarrollado por nuestro grupo. En la Figura 1se muestra su aplicación para el diagnósticomolecular del VHC: A) el CIC es añadido a lamuestra de plasma y procesado conjuntamentecon el ARN del VHC. B) Los ARNs de CIC y VHC son extraídos en forma conjunta. C) Ambos blancos(ARNs de CIC y VHC) son retrotranscriptos y D) amplificados en una única reacción con el mismo parde cebadores. E) Los amplicones resultantes son discriminados mediante hibridación líquida consondas no-radioactivas específicas para cada blanco y detectados colorimétricamente en formato EIA.El ensayo CICVHC RT-PCR tiene una sensibilidad analítica de 500 UI/ml de ARN-VHC, puede detectartodos los genotipos presentes en Argentina y es usado para el diagnóstico de VHC en pacientesatendidos en distintos Servicios Públicos de Salud.La versatilidad del producto permite su aplicación en la detección de virus con genoma a ARN deinterés humano, agropecuario (animales y vegetales), medioambientales y para la generación deestandares requeridos para las reacciones de amplificación en tiempo rea