Estudio de la sobre-expresión y topología de BlaR1 y MecR1 de Staphylococcus aureus

LLARRULL, L.I.; MIHOVILCEVIC, D.

Rosario

Jornada; Jornada CyT UNR 2017; 2017

Universidad Nacional de Rosario

Staphylococcus aureus es la principal causa de infecciones intra- y extra-hospitalarias en el mundo, con una creciente prevalencia de infecciones causadas por cepas resistentes a la acción de los antibióticos β-lactámicos (SAMR). SAMR expresa una transpeptidasa accesoria, PBP2a, de baja afinidad por la mayoría de los antibióticos β-lactámicos y una β-lactamasa, PC1, que son responsables del fracaso terapéutico de esta familia de drogas. El rápido desarrollo de resistencia a estos antibióticos representa un gran desafío para la prevención y el tratamiento de infecciones por S. aureus, el cual se ve incrementado dado el reducido número de compuestos antibacterianos en etapas finales de evaluación para el uso clínico. La expresión de PBP2a y de PC1 está regulada por las proteínas de membrana sensoras/transductoras MecR1 y BlaR1, respectivamente. Se desconocen los detalles moleculares de la activación de MecR1 y BlaR1, ya que estas proteínas no han podido ser sobre-expresadas y purificadas de forma completa. Estos sensores son blancos atractivos para el diseño de inhibidores que permitan restablecer la eficacia de los antibióticos β-lactámicos. En este proyecto pretendemos identificar los determinantes estructurales que dan lugar a la transducción de la señal en las proteínas MecR1 y BlaR1, dando lugar a la manifestación de resistencia. Para esto, buscaremos poner a prueba las siguientes hipótesis: 1) la fusión de BlaR1 y MecR1 completas o truncadas a otras proteínas de alta solubilidad o a otras proteínas de membrana permitiría la sobre-expresión de las mismas; 2) variantes más cortas funcionales de la proteína BlaR1 presentes en ciertas cepas de S. aureus resistentes, con un menor número de hélices transmembrana predichas, podrían ser mejores candidatas para la sobre-expresión en E. coli; 3) Para lograr la sobre-expresión de estas metaloproteasas es necesario emplear versiones inactivas de las mismas. A fin de poner a prueba estas hipótesis, proponemos los siguientes objetivos específicos: 1) expresar a BlaR1-JH1 salvaje ya BlaR1-E202A como fusión a Mistic y al dominio citoplasmático de MecR1 con la mutación E205A (cytMecR1-E205A) como fusión a EGFP; 2) purificar estas proteínas a homogeneidad; 3) evaluar la topología de las proteínas de fusión en E. coli. Para poder llevar a cabo nuestros objetivos, comenzamos construyendo los vectores que luego fueron utilizados en los ensayos de expresión de las proteínas de interés, como fusiones al C-terminal de MISTIC y al N-terminal de EGFP, en cepas de E. coli BL21 StarTM (DE3). Mediante La expresión fue verificada mediante resolución de los extractos celulares en geles de SDS-PAGE con tinción de Coomasie y por Western Blot utilizando anticuerpos específicos contra la proteína de interés. Posteriormente se puso a punto la purificación de Mistic-BlaR1JH1 utilizando mediante cromatografía de afinidad, utilizando una resina deNI-NTA. Se logró la purificación a homogeneidad, luego de realizar preparaciones de membrana y solubilización de las proteínas de membrana con el detergente ASB-14, obteniéndose una concentración de 0,08 µg/µL. La topología de Mistic-BlaR1JH1 fue evaluada mediante ensayos de susceptibilidad a ProteinasaK en esferoplastos de E. coli.