La acetilación de alfa-tubulina en la Lisina 40 de Trypanosoma cruzi y su importancia en la modulación del citoesqueleto

ALONSO, VICTORIA LUCIA; MARTINEZ PERALTA, GONZALO

Rosario

Jornada; I Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF; 2021

Facultad de Ciencias Bioquimicas y Farmacéuticas, UNR

Introducción. La Enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. En el presente proyecto se propone caracterizar la función de la α-tubulina acetilada en la remodelación y el mantenimiento del citoesqueleto de T. cruzi, un proceso de gran importancia durante los eventos de diferenciación celular que acompañan el desarrollo del ciclo de vida del parásito. Particularmente estudiar la función de la acetilación de la lisina 40 de α-tubulina de T. cruzi mediante la caracterización fenotípica de mutantes puntuales y su versión salvaje en este aminoácido expresadas en el parásito deforma inducible a través del vector pTcINDEX-GW.Resultados. En el laboratorio contábamos con cuatro construcciones diferentes delplásmido correspondientes a la α-tubulina salvaje y tres mutantes puntuales en el vectorpTcINDEX-GW (permite inducir la expresión en T. cruzi por tetraciclina). Las construccionesse realizaron incorporando un epítope de hemaglutinina (HA) en el extremo N-terminal dela secuencia codificante putativa para la α-tub de T. cruzi. Las tres mutantes puntuales seconsiguieron intercambiando la lisina 40 por: una arginina (K40R), aminoácido quemantiene la carga positiva pero no es acetilable, una glutamina (K40Q), que por suscaracterísticas fisicoquímicas mimetiza la lisina, reproduciendo la función de la tubulinaacetilada y una alanina (K40A), un aminoácido neutro. Mediante ensayos de western blot yde inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA no pudimos detectar la sobreexpresión dela α-tubulina exógena, pero si detectamos la sobreexpresión a nivel de ARNm cuandoindujimos con tetraciclina. Debido a esto pensamos que el epítope de HA podría estarinterfiriendo con el ensamblado de los microtúbulosy llevando a la degradación de la proteína o que talvez exista algún tipo de regulación en el extremo N-terminal que no permite el agregado del tag de HA.Cabe destacar que en el extremo N-terminal de estaproteína ocurren diversas modificaciones post-traduccionales (MPTs).A partir de estos resultados nos propusimos llevar a cabo nuevas transfecciones para lascuatro variantes (salvaje y mutantes), pero a partir de nuevas construcciones que agreguenel epítope de HA en el extremo C-terminal. Actualmente la construcción y transfección deestas nuevas versiones está en proceso.Conclusiones. La incorporación de “tags” en la tubulina no siempre es exitosa, la mayoríade los estudios in vivo de microtúbulos se han realizado expresando tubulina marcada aniveles reducidos en presencia de tubulina endógena. Muchas proteínas toleran un tag enun extremo, pero no en el otro. En el caso de la a-tubulina de T. cruzi no logramos visualizarel tag al incorporarlo al extremo N-terminal por lo que decidimos cambiar la estrategia yevaluar la incorporación de HA en el C-terminal.