Estrategias de expresion heterologa para la identificacion de transportadores de Trypanosoma cruzi

CANEPA GASPAR E; BOUVIER LEON A; MARIANA R. MIRANDA; PEREIRA CLAUDIO A

Buenos Aires

Jornada; VII JORNADAS CIENTIFICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MEDICAS ALFREDO LANARI; 2008

Universidad Buenos Aires

INTRODUCCIÓN: Los transportadores de metabolitos son proteínas intrínsecas de membrana y están involucrados en una amplia variedad de funciones vitales especialmente en organismos parásitos. Es por ello que en Trypanosoma cruzi, y otros kinetoplastidos de importancia sanitaria, son considerados potenciales blancos terapéuticos. La incapacidad de lograr la expresión funcional en sistemas heterólogos de estas proteínas, probablemente por su gran cantidad de pasos transmemebrana, en diversos modelos representa un gran impedimento para su caracterización molecular y bioquímica. Por esta razón es imperativo el desarrollo de nuevos sistemas de expresión adecuados para el estudio funcional de estas moléculas.   OBJETIVOS: El objetivo de este trabajo es expresar distintos miembros de la familia de transportadores de T. cruzi denominada AAAP, mediante ensayos de complementación en distintos modelos de levaduras que poseen mutaciones en los transportadores endógenos. Posteriormente se realizaran los estudios funcionales en estos organismos.    MATERIALES y METODOS: Tomando como punto de partida los transportadores de aminoácidos, en nuestro laboratorio estamos desarrollando un abordaje para la expresión de proteínas de membrana de T. cruzi. El sistema esta basado en una cepa de Saccharomyces cerevisiae que presenta una deleción para la permeasa general de aminoácidos (GAP1) de la cual se partió para realizar dobles mutantes en permeasas de aminoácidos especificas y de esta manera poder complementar con miembros de una familia de transportadores de T. cruzi.   RESULTADOS: Mediante curvas de inducción se logro poner a punto el sistema de expresión en levaduras utilizando dos plásmidos, uno de expresión inducible y otro de expresión constitutiva. De esta manera se evaluó una biblioteca de transportadores de aminoácidos de T. cruzi  para poder observar la complementación los mutantes ∆GAP1, ∆CAN1 que permiten identificar permeasas de arginina. Dos de los candidatos previamente identificados por mapeo de sintenia presentaron de manera preliminar diferencias significativas en el transporte de arginina.   CONCLUSIONES: Este sistema de expresión heteróloga constituye una valiosa herramienta para el desarrollo de ensayos “high-throughput” para identificar nuevos transportadores de T. cruzi.