EFECTO HIPERTROFICO Y FIBROTICO POR ESTIMULACION DIRECTA CON TRH EXOGENA EN CULTIVO DE LINEAS CELULARES: FIBROBLASTOS DE RATON NIH-3T3 Y CARDIOMIOCITOS DE RATA H9C2

AISICOVICH, M; LANDA, MS; PERES DIAZ, LS; GARCÍA, SI; SCHUMAN, ML

Jornada; XIV JORNADAS CIENTÍFICAS DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MÉDICAS ALFREDO LANARI; 2016

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MEDICAS ALFREDO LANARI UBA

Durante estos últimos años, con experimentos ?in vivo? demostramos que la TRH cardíaca (TRHc) participa de los procesos desencadenantes de la hipertrofia cardiaca como la hipertrofia, la apoptosis y marcadamente en la fibrosis (Schuman y col 2011;2014). En este sentido nuestros resultados nos llevaron a hipotetizar que la TRH debía actuar directamente sobre sus receptores descriptos en ambos tipos celulares (fibroblastos y miocitos). Comenzamos con el estudio de los fibroblastos cardíacos que poseen receptores para el tripéptido y son responsables de la fibrosis a través de la expresión de colágenos y la consecuente expansión de la MEC utilizando como modelo, la línea celular de fibroblastos de ratón NIH-3T3. Luego de 24 hs sin suero, el cultivo NHI-3T3 se estimuló con TRH en dos concentraciones (1 y 10 uM) durante 24 y 48 h, tiempo en los cuales un grupo de placas (n=8) se levantaron para extraer el RNA y cuantificar genes (TGFβ, col I y III, MMP 9y3) por PCR en tiempo real (syber green como fluoróforo intercalante). En otro grupo de placas (n=4) se cuantificaron las proteínas por inmunofluorescencia y se evaluó el tamaño celular en las distintas condiciones. Observamos un aumento significativo de la expresión de TGFβ en ambas concentraciones de TRH a las 24 h (P< 0.01) en mRNA y proteína que concuerda con los resultados de TGFβ. Así también observamos un aumento (p< 0.02) del área celular de los fibroblastos estimulados con TRH a ambos tiempos. Profundizando en la participación de la TRH en la fibrosis de los fibroblastos, decidimos evaluar si TRH media el efecto fibrótico de un fuerte inductor de fibrosis como es la AII efecto en el cual se sabe participa activamente el TGFβ. Siguiendo esa línea de pensamiento estimulamos los cultivos por 24h con AII 1uM con y sin bloqueo previo de TRH (lipofectamina+siRNA) y observamos que AII induce el aumento de TRH (p < 0.04) y que su bloqueo atenúa el marcado aumento de TGFβ y de la expresión de colágenos inducido por AII, mostrando por primera vez que la TRH actúa sobre los fibroblastos estimulando la expansión de la MEC (TGFβ, colágenos, etc.) y que su presencia es requerida para el efecto fibrótico inducido por AII. Por otro lado entendiendo que los miocitos y fibroblastos cardíacos actúan como un conjunto en las respuestas del corazón, comenzamos a evaluar los efectos del agregado de TRH exógena sobre cardiomiocitos de rata H9C2, células que han sido validadas por otros autores como modelo del miocito cardíaco demostrando que responden a los mismos estímulos que los cultivos primarios. Repitiendo el protocolo, luego de 24 hs sin suero, el cultivo de H9C2 se estimuló con TRH en las mismas concentraciones mencionadas para fibroblastos (1 y 10 uM) durante los mismos tiempos (24 y 48 h), y observamos por primera vez un aumento significativo de la expresión de TGFβ a las 48 hs sólo con la menor concentración (p < 0.01). En concordancia con el aumento de un inductor de hipertrofia como es el TGFB en estas células, encontramos un aumento significativo de BNP a ambas dosis y ambos tiempos (p < 0.02) indicando que la TRH es capaz de inducir hipertrofia en cardiomiocitos aislados. Decidimos además evaluar el efecto de TRH sobre otro marcador de hipertrofia como es la bomba SERCA2 que también está involucrada en la vía de señalización del Ca2+ intracelular afectando la contractilidad y a favor de lo que postulábamos, luego de la estimulación de TRH observamos un aumento significativo del contenido de SERCA2 a las 48 hs de la expresión del gen que fue confirmada por la cuantificación de la proteína por inmunohistoquímica (p < 0.01) sugiriendo que el tripéptido además de participar en la hipertrofia está involucrado en la señalización del Ca2+, no descripto hasta el momento. Nuestros resultados demuestran por primera vez los efectos de la TRH sobre células cardíacas y nos permiten concluir que el tripéptido induce fibrosis sobre los fibroblastos e hipertrofia y alteraciones en las vías de señalización del calcio en miocitos en forma directa.