Las nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi mantienen la homeostasis energética celular… ¿Sólo eso?

MIRANDA, MARIANA; CANEPA, GASPAR; BOUVIER, LEON; PEREIRA, CA

Buenos Aires

Jornada; VI Jornadas científicas del instituto de investigaciones medicas Alfredo Lanari; 2007

INTRODUCCIÓN: Las nucleósidos difosfato quinasas (NDPKs) son enzimas ubicuas, presentes en todos los organismos estudiados. Catalizan la interconversión de nucleósidos difosfato a trifosfato (ribo- y desoxiribo-) a través de reacciones de fosforansferencia. Si bien estas enzimas intervienen sólo en el  mantenimiento de la homeostasis celular de nucleósidos, algunas evidencias las han involucrado en otras funciones celulares. En este trabajo estudiamos dos isoformas de nucleósido difosfato quinasa de Trypanosoma cruzi denominadas TcNDPK1 y TcNDPK2, en cuanto a sus mecanismos de regulación, localización subcelular y nuevos roles a partir de su interacción con moléculas de ADN. OBJETIVOS: Caracterizar las nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi  y ampliar los conocimientos sobre  las funciones biológicas que estas enzimas llevan a cabo tanto en los parásitos como en otros organismos. MATERIALES y METODOS: La actividad NDPK fue medida realizando un ensayo colorimétrico con enzimas acopladas, siguiendo  la absorbancia a 340 nm. La localización subcelular se estudió a través del patrón de extracción con digitonina y por ensayos de Western Blot realizados utilizando sueros de ratones inmunizados con las correspondientes proteínas recombinantes. Los ensayos de interacción con ADN fueron llevados a cabo incubando NDPKs recombinantes con  ADN en diferentes topologías y condiciones. Posteriormente los ensayos son resueltos en geles de agarosa. RESULTADOS y CONCLUSIONES: En base a la “minería de datos” realizada en el proyecto genoma de T. cruzi, podrían existir 4 isoformas de NDPK, dos de las cuales fueron validadas bioquímicamente en este trabajo. Las dos isoformas denominadas TcNDPK1 y TcNDPK2 fueron clonadas y expresadas en sistemas heterólogos y mostraron actividad bioquímica NDPK. En base a la extracción diferencial con digitonina en muestras de epimastigotes de T. cruzi, la actividad  nucleósido difosfato quinasa se localiza en múltiples fracciones subcelulares de los parásitos. A su vez, TcNDPK1 y TcNDPK2 difieren en sus mecanismos de regulación y expresión a lo largo del ciclo de vida del parásito. Sorprendentemente, TcNDPK1 (y no TcNDPK2) puede unirse y clivar moléculas de ADN en distintas topologías. Estos resultados sugieren nuevas funciones biológicas para esta enzima, probablemente no asociadas al rol que cumplen en la homeostasis energética celular.