VECTORES DE EXPRESIÓN PARA TRYPANOSOMA CRUZI CON MARCADORES DE SELECCIÓN PARA DIFERENTES ANTIBIÓTICOS.

LEÓN A. BOUVIER, MARÍA DE LOS MILAGROS CÁMARA, MARIANA R. MIRANDA Y CLAUDIO A. PEREIRA

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2011

sociedad argentina de protozoologia

La forma más frecuente y convencional de manipulación genética empleada en Trypanosoma cruzi consiste en la introducción de vectores de expresión. Estas herramientas se pueden dividir en variantes más simples como vectores episomales y aquellos derivados que al incluir promotores ribosomales adquieren naturaleza integrativa. Por dos décadas la estructura constituyente más exitosa y estable de estas moléculas corresponde al marcador de selección para G418 originalmente desarrollado para el vector pTEX (Kelly y col. 1992). Sin embargo formas más ambiciosas de manipulación genética requieren marcadores de selección adicionales. En este trabajo se desarrollaron y construyeron series de vectores de expresión para la proteína verde fluorescente tanto de naturaleza episomal como integrativos para los genes de resistencia a phleomicina, blasticidina S, higromicina B, G418 y puromicina. Se evaluaron los niveles de expresión derivados de cada uno de los vectores en líneas de parásitos seleccionados con los respectivos agentes selectivos. Con los vectores integrativos fue posible obtener elevados niveles de expresión en los parásitos seleccionados con G418, higromicina B y blasticidina S. Por su parte en los equivalentes relativos a phleomicina, si bien se mostraron resistentes al antibiótico no se pudo detectar expresión del gen reportero. De manera similar en los parásitos transfectados con las construcciones episomales los niveles de expresión fueron menores y los antibióticos más efectivos resultaron ser G418, higromicina B y blasticidina S. En este contexto la construcción con el gen de resistencia a phleomicina, no solo confirió resistencia sino que fue posible detectar tanto de forma microscópica como inmunológica la expresión de la proteína verde fluorescente en los parásitos relativos a la misma. Sin importar el tipo de vector, no fue posible obtener líneas resistentes a puromicina. Estas herramientas no solo constituyen formas atractivas para la expresión simultanea de múltiples secuencias codificantes de interés, sino que también permiten establecer estrategias de selección para diferentes cepas y metodologías de cultivo.