TCADKN: UNA ADENILATO QUINASA LOCALIZADA EN EL NÚCLEO DE TRYPANOSOMA CRUZI

MARÍA M. CÁMARA, LEÓN A. BOUVIER, MARIANA M. MIRANDA Y CLAUDIO A. PEREIRA

buenos aires

Jornada; X jornadas cientificas del instituto lanari; 2011

insituto lanari

Introducción: Las adenilato quinasas son un grupo de enzimas responsables de mantener la homeostasis celular de ATP, catalizando la interconversión de nucleótidos de adenosina. Por esta razón, se encuentran ubicadas en regiones donde tienen lugar la síntesis y el consumo de ATP. Las células eucariotas típicas poseen tres isoformas, mientras que en tripanosomátidos se han identificado por lo menos tres isoformas adicionales. La gran diversidad de condiciones a las que se enfrentan estos parásitos durante su ciclo de vida es una posible explicación de esta diferencia. Recientemente han sido caracterizadas isoformas de adenilato quinasas nucleares en D melanogaster, S cereviciae, C. elegans y humanos. En este trabajo, presentamos el estudio de la isoforma de adenilato quinasa nuclear, TcAdKN. Objetivos: Dar los primeros pasos en el estudio funcional de una isoforma de adenilato quinasa nuclear. Metodología: Los epimastigotes (estadio replicativo no infectivo) de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener, salvajes o modificados genéticamente, se cultivan a 28°C en medio LIT (triptosa de infusión de hígado). Para la localización subcelular de TcAdKN por inmunofluorescencia, los parásitos se fijan y permeabilizan para luego incubarlos con el anticuerpo especifico y finalmente con anticuerpo secundario asociado a fluoróforos. Como marcadores de localización se utilizarán colorante DAPI (nuclear). Para la sobre-expresión de las proteínas de interés, se construirán modelos de parásitos transgénicos a partir de epimastigotes salvajes. Los parásitos se transfectarán mediante las técnicas clásicas, utilizando plásmidos completamente diseñados en nuestro laboratorio. Resultados y conclusiones: A partir de la información disponible sobre secuencias aminoacídicas de adenilato quinasas nucleares de otros organismos, se buscaron sus homólogos en T.cruzi. El gen correspondiente fue clonado, se sobre-expresó en bacterias E. coli y se purificó la proteína obtenida. Mediante análisis bioquímicos de actividad enzimática, se pudo validar la actividad de adenilato quinasa y de ATPasa de dicha enzima. Para estudiar la localización subcelular, se diseñó un plásmido que expresaba la enzima TcAdKN fusionada a GFP (proteína verde fluorescente) y se transfectaron parásitos en el estadío de epimastigotes. Luego del proceso de selección, se obtuvo como resultado del análisis, una localización claramente nuclear y parcialmente citosólica. Para determinar la posible señal de localización nuclear, se realizaron fusiones de distintos segmentos de la proteína a GFP. Luego de las transfecciones, se pudo ver que los parásitos que contenían la porción amino terminal de la proteína presentaban una distribución nuclear, mientras que la porción carboxilo terminal mostró un patrón citosólico. Por esto, se determinó que la señal imprescindible para que TcAdkN se ubique en el núcleo se encontraría en el amino terminal de la proteína.