Descubriendo las subtilasas: un método de revelado in vivo

MARIA FLORENCIA GALOTTA; IRMA N. ROBERTS

Quilmes

Jornada; I Reunión Argentina de Biología de Semillas (RABioS); 2019

Facultad de Agronomia, UBA y Universidad Nacional de Quilmes

Las serín-proteasas vegetales se dividen en 14 familias, dentro de las cuales las subtilasas (familia S8A) constituyen la más numerosa. Las subtilasas intervienen en procesos tales como la movilización de reservas en semillas, muerte celular programada, desarrollo reproductivo y senescencia. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método sencillo y rápido para revelar la actividad de subtilasas in vivo en semillas de diferentes cultivos durante su germinación. El método consiste en aplicar una alícuota del péptido sintético suc-AAPF-pNA, un sustrato específico para subtilasas, directamente sobre semillas germinadas diseccionadas longitudinalmente. Luego de 15 a 30 min de incubación, se revela la presencia de p-nitroanilina libre (pNA) por adición secuencial de nitrito de sodio 0,1%, sulfamato de amonio 0,5% y N-(1-naftil)etilendiamina 0,05 M. De esta forma, la pNA liberada por la acción enzimática adquiere un color rosado intenso y resulta fácilmente visible. El procedimiento descripto se aplicó sobre semillas de trigo, maíz, sorgo, arroz, cebada y soja en distintos estadios de germinación. En soja, también se examinó la utilidad del método para revelar la actividad de subtilasas durante el desarrollo del grano. En todos los casos, se observó la tinción de los granos con solo 15 min de incubación y un aumento de la intensidad de la coloración hasta los 30 min. La naturaleza enzimática del proceso se evidenció por el agregado de inhibidores de proteasas (PMSF y quimostatina) a los granos previo a la aplicación del sustrato. Los granos tratados con PMSF (inhibidor de serín-proteasas) no presentaron coloración alguna y los tratados con quimostatina (inhibidor de proteasas tipo quimotripsina) presentaron menor intensidad de coloración. En cebada, se aplicó el método a granos en germinación desde 0 a 5 días después de imbibición observando que la actividad de subtilasas aumentó conforme avanza la germinación y detectando también coloración en las raicillas. En soja, la actividad de subtilasas se detectó en los cotiledones de 3 días de germinación, granos en desarrollo (R5.1) y especialmente en el tegumento. En todas las especies y tejidos analizados por el método in vivo, la actividad de subtilasas se confirmó con un método estándar de medición de actividad enzimática en extractos usando el sustrato suc-AAPF-pNA. En este trabajo se describe por primera vez un método que permite revelar la actividad de subtilasas in vivo en diversos tejidos de varios cultivos, demostrando además la participación de estas enzimas tanto en la germinación como el desarrollo de los granos.