Descripción de un método para la determinación in vivo de la actividad de subtilasas en semillas en germinación

IRMA N. ROBERTS; MARIA FLORENCIA GALOTTA

Buenos Aires

Jornada; VIII Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2018

Fac. Cs. Veterinarias, UBA

Lassubtilasas constituyen una familia dentro de las serín proteasas que cumplendiferentes roles durante el desarrollo vegetal. El objetivo de este trabajo fuedesarrollar un método sencillo y rápido para la determinación de la actividadde subtilasas in vivo, durante lagerminación de semillas de 5 cultivos. Semillas de trigo, maíz, sorgo, arroz ysoja, fueron desinfectadas superficialmente y puestas a germinar a 22ºC sobrepapel de filtro humedecido en placas de Petri. Las semillas fueron muestreadasa los 2 (soja), 4 (trigo, maíz, sorgo y soja), y 8 días (arroz). Sediseccionaron longitudinalmente, y pusieron sobre papel de filtro estéril. Elpéptido sintético Suc-AAPF-pNA, sustrato específico de subtilasas, fue aplicadosobre los granos diseccionados en concentración 10 µM. Las semillas fueronincubadas durante 0, 15 y 30 minutos, en presencia del sustratoen oscuridad a 30ºC. La diazotización del pNA liberado fue llevada a cabo medianteel agregado de las siguientes soluciones: nitrito de sodio 0,1% en HCl 1 M,sulfamato de amonio 0,5% en HCl 1 M, y N-(1-naftil)etilendiamina0,05 M en etanol 47,5%. Luego de la diazotización, el pNA libre toma un colorrosado intenso revelando la actividad de subtilasas. En el caso de trigo, maízy sorgo, se visualizó actividad de subtilasas luego de 15 minutos de incubaciónen presencia del sustrato, y no se observaron diferencias significativasrespecto del tratamiento de 30 minutos de incubación. En el caso del arroz, elendosperma del grano tomó un color rosado intenso luego de 30 minutos deincubación. En soja, el tegumento presentó una leve tinción rosada, mientrasque los cotiledones (tejido de reserva de las dicotiledóneas) no presentaronactividad de subtilasas para ninguno de los tiempos de incubación. De acuerdo abibliografía, existe una alta actividad de subtilasas en las etapas degerminación temprana en soja. Por lo tanto, se evaluaron granos de dos días degerminados. Esta vez, se observó una tinción aún más intensa del tegumento,indicando mayor actividad de subtilasas respecto de granos de 4 días. Porúltimo, para comprobar la especificidad del método, granos de trigo fueronincubados durante 0 y 15 minutos en presencia de fluoruro defenilmetilsulfonilo (PMSF) 5 mM, inhibidorespecífico de serín proteasas, y quimostatina, inhibidor de cisteín y de algunasserín proteasas del tipo quimotripsina, 100 µM. El resto del ensayo siguió comofue detallado previamente para la incubación de 30 minutos en presencia deSuc-AAPF-pNA. Los controles correspondientes con etanol (solvente de PMSF) ydimetilsulfóxido (solvente del sustrato y de quimostatina) fueron llevados acabo. Los granos que fueron incubados en presencia de PMSF y/o quimostatina nopresentaron la coloración rosada vista previamente en el caso de trigo,indicando la ausencia de actividad de subtilasas debido a la especificidad deestos inhibidores. No se vieron diferencias entre la pre-incubación de 0 y 15minutos. Por consiguiente, creemos que este es un método rápido y eficaz paraevaluar la actividad in vivo e in situ de subtilasas.