Identificación y caracterización de 39 miembros de la familia de subtilisinas en cebada

MARIA FLORENCIA GALOTTA; IRMA N. ROBERTS; ANALI D. ROLDAN

Pergamino

Congreso; VIII Congreso Nacional de Trigo - VI Simposio de Cereales de Siembra Otoño Invernal - II Encuentro del Mercosur; 2016

AIANBA | Asociación de Ingenieros Agrónomos de la zona Norte de la Pcia de Buenos Aires

Las serín-proteasas vegetales sedividen en 14 familias, de las cuales la familia de las subtilisinas (S8) esuna de las más numerosas. Las subtilisinas vegetales caracterizadas a la fechahan sido asociadas a numerosos aspectos del crecimiento y desarrollo de lasplantas, entre ellos la senescencia foliar. En el genoma de Arabidopsis thaliana se han identificado56 genes para subtilisinas y en el de arroz 63, todos ellos pertenecientes a lasubfamilia S8A. En cebada, la familia de subtilisinas aun no ha sido descripta.En el presente trabajo, se reporta la identificación de 39 genes codificantes para subtilisinas reconocidos enbases de datos de cebada a partir de regiones conservadas de subtilisinas de trigo. La alineación de las secuencias aminoacídicasusando el software Clustal Omega reveló que los productos de los genes identificadoscomparten entre un 27,71 y 90,59% de homología y que, con excepción de BAK03601(gen AK372403), todas las proteasas codificadas contienen la tríada catalítica típicade las subtilisinas (Asp, His, Ser). El análisis de las secuencias a través delas herramientas de la base de datos CDD para identificación de dominiosconservados, reveló que todos los productos de los genes identificadospresentan tres dominios asociados a subtilisinas: l9 (pfam05922: Inhibitor_I9), S8-3 (cd04852: Peptidases_S8_3) y PA (cd02120: PA_subtilisin_like). Por otro lado, elanálisis de la posible localización subcelular de las 39 proteínas utilizando lasherramientas PredoTar, WolfPSort, BaCelLo y TargetP indica que la mayoría delas subtilisinas analizadas poseen secuencias señal de localización a la víasecretoria y al cloroplasto, si bien se observaron algunas discrepancias entrelos diferentes programas de predicción utilizados. Con el fin de determinar larelación de los genes identificados y el proceso de senescencia foliar, sediseñaron pares de cebadores específicos para cada una de las secuencias y seanalizó su expresión por RT-PCR en hojas verdes y senescentes de plantas decebada en estado reproductivo (estadio 5.5-5.7 de la escala Zadoks). Losresultados obtenidos mostraron que solo 4 (AK362668, AK365933, AK362004, AK3684369)de las 39 secuencias analizadas aumentan su expresión durante la senescenciafoliar, mientras que 11 (AK355951, AK370987, AK370424, AK366129, AK372865,AK375659, AK368425, AK368290, AK360024, AK363635, AK363612) se ven reprimidas y6 (AK356563, AK376432, AK361952, AK357644, AK371975, AK374646) no presentancambios significativos en su expresión entre hojas verdes y senescentes. Elresto de los genes analizados no pudieron ser detectados. Los resultadosobtenidos aportan por primera vez información sobre la caracterización de lafamilia de subtilisinas en cebada y demuestran que 10 de los 39 miembros hasta ahoraidentificados aumentan o mantienen su expresión durante el normal desarrollo dela senescencia.